[发明专利]一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法

摘要

本发明涉及一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交（Genome in situ hybridization in suspension,GISHIS）的方法，包括细胞周期同步化、染色体悬浮液制备、基因组探针制备、样品与基因组探针变性、悬浮液中进行基因组原位杂交。滴片镜检，若悬浮液中产生绿色荧光信号，则判定为斑茅染色体，说明成功将绿色荧光标记到斑茅染色体上了。利用流式细胞仪，可以对染色体悬浮液中特异标记绿色荧光信号的斑茅染色体实现分选并进行相关测序研究，为研究复杂多倍体斑茅基因组提供了新的、有效可行的方法。本发明可应用于各种作物中属间杂交后代的染色体悬浮液中进行基因组原位杂交。

主权项

1.一种在染色体悬浮液中进行基因组原位杂交的方法，其特征在于杂交步骤如下：（1）避光培养催根：选择甘蔗与斑茅杂交后代根点良好的茎段，洗干净后，在25‑28 ℃条件下，用珍珠岩颗粒为基质，表面也覆盖珍珠岩颗粒，避光培养催根，期间保持湿润；（2）细胞周期同步化处理：取步骤（1）的根尖进行细胞周期同步化处理，获取中期相细胞，通过中期相细胞获得大量的中期染色体；所述细胞周期同步化处理：在25℃的培养箱中，将蔗茎竖直放在500 mL的塑料盒子中，用2.0 mM 羟基脲溶液处理18 h；ddH₂O处理5 h；在2.5 μM 甲基胺草磷溶液中处理3 h，富集足够多的中期染色体；（3）染色体悬浮液制备：用剪刀剪取步骤（2）同步化处理后的根尖部 0.5‑1.5 cm；在4 ℃低温水浴锅中，用体积百分率2 %甲醛固定液固定20 min，Tris Buffer洗3次，5 min/次；然后，切1‑1.5 mm根尖，每30个根尖放入装有500 μL LB01 缓冲液的2.0 mL的离心管中；用匀浆仪，18000 rpm匀浆15 s，然后用50 μm膜过滤，放4 ℃备用；（4）斑茅基因组探针制备：配制20 μL荧光标记反应液，其中包含6 μL 0.1mM dNTP mix with FITC，4 μL Nick Translation Mix，1.5 μg 斑茅基因组DNA，用ddH₂O补足至20 μL；反应液在15 ℃条件下反应5 h，即为含有FITC荧光标记的斑茅基因组探针；Badila基因组探针制备：配制20 μL无荧光标记反应液，其中包含6 μL 0.1 mM dNTP mix，4 μL Nick Translation Mix，1.5 μg Badila基因组DNA，用ddH₂O补足至20 μL；反应液在15 ℃条件下反应5 h，即无荧光标记的Badila基因组探针；（5）变性处理：取步骤（3）过滤后的染色体悬浮液，在每管染色体悬浮液样品中加入200 μL 去离子甲酰胺，混匀；在99 ℃水浴锅中变性5 min，然后转入冰水中处理10 min；配制杂交液：配制100 μL体系，50 μL FD，10 μL 20×SSC，斑茅基因组探针15 μL，Badila基因组探针15 μL，用水补足100 μL，混匀后，在99 ℃水浴锅中变性5 min，然后转入冰水中处理10 min；（6）染色体悬浮液原位杂交：取步骤（5）装有变性处理后染色体悬浮液样品的2.0 mL离心管，在每管样品中加入100 μL步骤（5）的杂交液；在37 ℃培养箱中，将样品放在旋转混匀仪上混匀、杂交；（7）杂交完成后，用离心机5000 rpm离心8 min，去上清液；再加入500 μL LB01缓冲液用混匀仪震荡、混匀，重新悬浮染色体；取染色体悬浮液滴在玻片上，通过荧光显微镜，能检测到特异绿色荧光信号的，即为斑茅染色体。