[发明专利]一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法有效

专利信息
申请号: 201910212299.X 申请日: 2019-03-20
公开(公告)号: CN110066878B 公开(公告)日: 2023-06-02
发明(设计)人: 苏薇薇;朱晓枭;吴灏 申请(专利权)人: 中山大学
主分类号: C12Q1/6888 分类号: C12Q1/6888;C12N15/11
代理公司: 广州容大知识产权代理事务所(普通合伙) 44326 代理人: 刘新年;黄开艳
地址: 510275 广东*** 国省代码: 广东;44
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摘要: 发明公开了脑心通胶囊地龙药材的DNA分子鉴别方法。本方法采用蛋白酶K消化动物药组分,广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取胶囊中的植物药组分。基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ设计3对地龙特异性引物进行PCR扩增;将产物电泳检测测序,所得序列在GenBank数据库中用BLAST进行判定,以相似性最高的序列对应物种为最接近物种。本发明的地龙特异性引物可扩增200‑350bp的小片段基因,不受地龙的外在形态限制,避免了DNA降解造成的影响,具有专属性强,准确通用的优点。本方法可针对含地龙细粉的中药制剂进行地龙成分鉴定,填补了脑心通胶囊在地龙质量控制方面的空白,提高了该药的质量控制水平。
搜索关键词: 一种 脑心通 制剂 地龙 药材 dna 分子 鉴别方法
【主权项】:
1.一种脑心通制剂中地龙药材的DNA分子鉴别方法,其特征在于包括以下步骤:(1)脑心通制剂总DNA的提取:用蛋白酶K消化制剂中动物组分,按广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分;得总DNA的提取物;(2)PCR扩增:反应体系为15μL,脑心通制剂总DNA模板0.5μL,浓度为50.00±0.50ng/μL,10×PCR缓冲液1.5μL,25mM MgCl2溶液1.5μL,2.5mM dNTPs 1.2μL,地龙特异性引物:10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL,5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL,ddH2O 8.7μL;PCR扩增反应程序为:95℃3min;95℃45s,55℃或58℃45s,72℃1min,39个循环;72℃5min;所述地龙特异性引物包括3个引物对,序列如下:COI Metaphire F2/R2:COI Metaphire F2:5’‑TTAGTGTCGTCCGCCGCAGTT‑3’,COI Metaphire R2:5’‑CTACTGCCCACACAAATAGTGGG‑3’,扩增片段长度为232bp;COI AA F2/R1:COI AA F2:5’‑CTTGGAAGAGATCAGCTATAC‑3’,COI AA R1:5’‑CTAAAATTGATGAGGCACCC‑3’,扩增片段长度为337bp;COI AA F3/R1:COI AA F3:5’‑TTTGGAAACTGACTGCTCCCA‑3’,COI AA R1:5’‑CTAAAATTGATGAGGCACCC‑3’,扩增片段长度为247bp。(3)电泳检测及测序:取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合,电泳,得单一明亮条带,纯化,测序;(4)鉴定:将步骤(3)中测得序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行结果判定,结果中相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。
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