[发明专利]一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法

摘要

本发明公开了一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法，该方法采用蛋白酶K消化动物药组分，广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取植物药组分；基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ设计水蛭特异性引物进行PCR扩增；将产物电泳检测测序，获得的序列在GenBank数据库中应用BLAST进行结果判定，以相似性最高的序列物种为待测样品最接近的物种。本水蛭特异性引物可扩增140～200bp的小片段基因，能针对脑心通胶囊中水蛭粉末进行鉴定，不受水蛭的外在形态限制，避免了DNA降解造成的影响，具有专属性强，准确通用的特点，填补了脑心通胶囊在水蛭质量控制方面的空白。

主权项

1.一种脑心通制剂中水蛭药材的DNA分子鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：(1)脑心通制剂总DNA的提取：先用蛋白酶K消化动物组分，再按照广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分，得总DNA提取物；(2)PCR扩增：以步骤(1)所得总DNA提取物作为模板，进行PCR扩增；反应体系为15μL，其中总DNA模板0.5μL，浓度为50.00±0.50ng/μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl₂溶液1.5μL，2.5mM dNTPs1.2μL，特异性引物为10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，ddH₂O8.7μL；PCR扩增反应程序为：95℃3min；95℃45s，55℃45s，72℃1min，39个循环；72℃5min；所述特异性引物包括3个引物对，序列如下：COI WP F1/R2序列：COI WP F1：5’‑TTGGTGGGTTTGGTAATTGAC‑3’，COI WP R2：5’‑GATGGGCCTGAATGAGATACG‑3’，扩增片段长度为202bp；COI WP F2/R2序列：COI WP F2：5’‑TGGGTTTGGTAATTGACTC‑3’，COI WP R2：5’‑GATGGGCCTGAATGAGATACG‑3’，扩增片段长度为198bp；COI HN F1/R2序列：COI HN F1：5’‑GCCATTAATAGTTGGAGCAG‑3’，COI HN R2：5’‑CGGATATAATGTTCATCCAGC‑3’，扩增片段长度为142bp；(3)电泳检测及测序：取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳20‑30min后，得单一明亮条带，纯化后测序；(4)鉴定：步骤(3)中测得序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行对比，相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。