[发明专利]同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒

摘要

本发明公开了同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物、方法及试剂盒。上述四类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌和赭曲霉毒素产生菌。基于多重PCR检测方法，包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对。本发明建立了一种不经过分离纯化，直接检测中药材污染产毒真菌的多重PCR体系，各引物特异性强，方法的检出限为10²～10³CFU/g，检测灵敏度高。

主权项

1.同时检测中药材污染四类产毒真菌的多重PCR引物，上述四类产毒真菌为黄曲霉毒素产生菌、杂色曲霉毒素产生菌、伏马菌素产生菌和赭曲霉毒素产生菌，其特征在于：包括能在同一反应管中进行PCR反应的第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对和第五引物对，其中，第一引物对用以扩增真菌rDNA基因Wen，包括正向引物Wen2F和反向引物Wen2R，分别包括SEQ ID NO.01和SEQ ID NO.02所示的序列；正向引物Wen2F为5’‑TTCCATGCGAGCCCAACCTCCC‑3’，反向引物Wen2R为5’‑AGGGGACGACGACCCAAACA‑3’；第二引物对用以扩增黄曲霉毒素合成基因AF，包括正向引物AF‑1F和反向引物AF‑1R，分别包括SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04所示的序列；正向引物AF‑1F为5’‑GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC‑3’，反向引物AF‑1R为5’‑GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG‑3’；第三引物对用以扩增黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素共同的合成基因AFST，包括正向引物AFST‑1F和反向引物AFST‑1R，分别包括SEQ ID NO.05和SEQ ID NO.06所示的序列；正向引物AFST‑1F为5’‑GGCCCTTGTGGTGGGGTTCAAATCGGTGA‑3’，反向引物AFST‑1R为5’‑CTTAGGTGACGACTTGGCGGGCTTTGATC‑3’；第四引物对用以扩增赭曲霉毒素合成基因OTA，包括正向引物OTA‑1F和反向引物OTA‑1R，分别包括SEQ ID NO.07和SEQ ID NO.08所示的序列；正向引物OTA‑1F为5’‑GCCAGACCATCGACACTGCATGCTC‑3’，反向引物OTA‑1R为5’‑CGACTGGCGTTCCAGTACCATGAGCC‑3’；第五引物对用以扩增伏马菌素合成基因Fum，包括正向引物Fum‑1F和反向引物FB‑1R，分别包括SEQ ID NO.09和SEQ ID NO.10所示的序列；正向引物FB‑F为5’‑GAGCTTGTCCTTCTCACTGG‑3’，反向引物FB‑R为5’‑GAGCCGACATCATAATCAGT‑3’。