[发明专利]一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法

摘要

本发明提供一种烟草NtNHX2基因的克隆及在不同逆境下表达模式的分析方法，以烟草幼苗总RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示在1500‑2000bp的位置上有一条清晰的条带，条带单一，无弥散现象，长度大小与预期目标相符,对该条带进行回收、纯化测序，测序结果显示目的片段大小为1605bp；然后根据该NtNHX2基因序列，采用DNAMAN设计qRT‑PCR引物NtNHX2‑qF、NtNHX2‑qR，以烟草的18S rRNA为内参基因进行表达差异分析，基因相对表达水平用2^‑ΔΔCt方法进行计算；3次重复，运用qRT‑PCR分析NtNHX2在不同组织中的特异性表达及其在高盐、低钾、干旱、4℃、ABA胁迫下的基因表达水平，为NtNHX2的功能研究、探讨其耐盐机制及基因利用提供理论依据。

主权项

1.一种烟草NtNHX2基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：a. 依据GenBank收录的NtNHX2基因序列LOC107808863，用DNAMAN 软件设计出基因克隆引物：正向引物：NtNHX2‑F：ATGGCGTCTGAGCTGGC；反向引物NtNHX2‑R：TCATGGTTCCTGTTCCGTTG；b. 利用Trizol试剂提取烟草幼苗总RNA，经cDNA合成试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，用引物NtNHX2‑F/NtNHX2‑R进行PCR扩增；c. 使用DNA凝胶纯化回收试剂盒将目的片段纯化，将其与pMD19‑T载体在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后将感受态细胞加入到含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上涂板，37℃过夜倒置培养;d. 用牙签挑取少量菌落进行PCR检测，筛选出阳性克隆进行测序。