[发明专利]一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，将血浆白蛋白还原烷基化和胰蛋白酶酶解后，通过“纳升液相色谱‑多级质谱(nL‑MSn)结合“同位素标记的相对定量和绝对定量技术(iTRAQ)”定性定量分析血浆白蛋白非酶糖基化。通过还原烷基化及胰蛋白酶酶解将血浆白蛋白降解成肽段，通过纳升液相分离后再通过高分辨率质谱获取氨基酸序列、糖基化位点信息，并通过iTRAQ报告离子实现糖基化位点的准确定量。本发明实现了对血浆白蛋白糖基化位点全面的定性和定量分析，可用于监测血糖浓度和早期糖尿病的检测。

主权项

1.一种定性定量分析非酶糖基化血浆白蛋白的方法，其特征在于，包括步骤如下：(1)在血浆中加入PEG‑6000，采用PEG沉淀法除去血浆中的球蛋白，保留含有血浆白蛋白的上清液待用；定性分析进入步骤(2)，定量分析进入步骤(3)；(2)采用亲和色谱分离糖基化HSA；(3)HSA还原烷基化；(4)将胰蛋白酶加入还原烷基化后的蛋白质溶液中，胰蛋白酶与蛋白质溶液的质量比为1:25，在37℃下孵育过夜；定性分析进入步骤(8)，定量分析进入步骤(5)；(5)标记用于定量实验的酶解HSA；(6)采用亲和色谱柱分离标记后的糖基化HSA肽段；(7)C18 Ziptip脱盐；定量分析进入步骤(9)；(8)纳升液相色谱‑多级质谱定性分析：将步骤(4)中经过胰蛋白酶酶解的糖基化HSA溶于去离子水，配制成浓度为1μg/uL的溶液；流动相A：含0.1％甲酸的2％乙腈溶液；流动相B：含0.1％甲酸的98％乙腈溶液；用ReproSil‑Pur C18‑AQ Trap色谱柱和ReproSil‑Pur C18‑AQ色谱柱分离，流速为300nL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～5min，0％流动相B；5～20min，0％～10％流动相B；20～65min，10％～32％流动相B；65～85min，32％～50％流动相B；85～90min，50％～100％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～102min，100％～0％流动相B；102～120min，0％流动相B；定性分析进入步骤(10)；(9)纳升液相色谱‑多级质谱‑iTRAQ标记定量分析：将步骤(7)中经过胰蛋白酶酶解的iTRAQ标记的糖基化HSA溶于去离子水，配制成浓度为1μg/uL的溶液；流动相A：含0.1％甲酸的2％乙腈溶液；流动相B：含0.1％甲酸的98％乙腈溶液；用ReproSil‑Pur C18‑AQ Trap色谱柱和ReproSil‑Pur C18‑AQ色谱柱分离，流速为300nL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～5min，0％流动相B；5～20min，0％～10％流动相B；20～65min，10％～32％流动相B；65～85min，32％～50％流动相B；85～90min，50％～100％流动相B；90～100min，100％流动相B；100～102min，100％～0％流动相B；102～120min，0％流动相B；定量分析进入步骤(11)；(10)在正离子模式下用高分辨质谱仪进行定性分析，得到高分辨质谱图；定性分析进入步骤(12)；(11)在正离子模式下用高分辨质谱仪进行定量分析，得到高分辨质谱图；定量分析进入步骤(13)；(12)根据步骤(10)中获得的高分辨质谱图，使用Proteome Discoverer软件实现对HSA糖基化位点的定性分析；(13)根据步骤(11)中获得的高分辨质谱图，使用Proteome Discoverer软件实现对HSA糖基化位点的定量分析。