[发明专利]一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法，包括如下步骤：1）设计用于扩增组成人HOPS复合体的6种基因的编码区的引物；2）分别构建pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS11、pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS18、pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS39的重组质粒；分别构建pGEX 4T‑1‑GST‑TEV‑Flag‑VPS16、pGEX 4T‑1‑GST‑TEV‑Flag‑VPS33、pGEX 4T‑1‑GST‑TEV‑Flag‑VPS41的重组质粒；3）将步骤2）构建的6种重组质粒分别转化大肠杆菌细胞，再进行融合蛋白的诱导表达和分离纯化。本发明可以简便地获得高特异性的HOPS复合物蛋白，为膜蛋白的分离纯化提供了更好的方法，能够为生物化学等基础研究提供支持。

主权项

1.一种制备、纯化HOPS复合物蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）设计用于扩增组成人HOPS复合体的6种基因的编码区的引物；所述的6种基因为：人VPS11基因、人VPS18基因、人VPS39基因、人VPS16基因、人VPS33基因、人VPS41基因；分别扩增得到人VPS11基因、人VPS18基因、人VPS39基因、人VPS16基因、人VPS33基因、人VPS41基因片段；2）分别构建pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS11、pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS18、pET‑His‑ NusA‑TEV‑HA‑VPS39的重组质粒；分别构建pGEX 4T‑1‑ GST‑TEV‑Flag‑VPS16、pGEX 4T‑1‑ GST‑TEV‑Flag‑VPS33、pGEX 4T‑1‑ GST‑TEV‑Flag‑VPS41的重组质粒；3）将步骤2）构建的6种重组质粒分别转化大肠杆菌细胞，再进行融合蛋白的诱导表达和分离纯化；其中，针对pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS11、pET‑His‑NusA‑TEV‑HA‑VPS18、pET‑His‑ NusA‑TEV‑HA‑VPS39，IPTG诱导表达，且在22°C条件下诱导16 h，IPTG诱导终浓度为0.2 mmol/L，然后采用Ni柱亲和层析的方法纯化蛋白；针对pGEX 4T‑1‑ GST‑TEV‑Flag‑VPS16、pGEX 4T‑1‑ GST‑TEV‑Flag‑VPS33、pGEX 4T‑1‑ GST‑TEV‑Flag‑VPS41，IPTG诱导表达，IPTG诱导终浓度为0.2 mmol/L，诱导温度为28°C，诱导时间为5 h，然后采用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法纯化蛋白。