[发明专利]一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法

摘要

本发明公开了一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，包括以下步骤：收集人肝癌细胞SMMC‑7721和MHCC‑97H、人正常肝细胞WRL‑68以及肝星状细胞HSC、血管内皮细胞ECV304，提取总RNA，利用real‑timePCR技术检测多种MicroRNAs的表达，并将癌细胞中表达量与正常细胞比较，筛选出一组特异MicroRNAs；根据筛选出的特异MicroRNAs序列，构建其干预载体，转染SMMC‑7721、MHCC‑97H、WRL‑68、HSC、ECV304。提出肝癌转移发生的新观点，有助于筛选针对miRNAs靶基因的干预性治疗策略，防治肝癌侵袭、转移和复发。

主权项

1.一种肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、收集人肝癌细胞SMMC‑7721和MHCC‑97H、人正常肝细胞WRL‑68以及肝星状细胞HSC、血管内皮细胞ECV304，提取总RNA，利用real‑timePCR技术检测多种MicroRNAs的表达，并将癌细胞中表达量与正常细胞比较，筛选出一组特异MicroRNAs：miR‑21、miR‑26a、miR‑199a‑3p、miR‑122、miR‑151、miR‑221；S2、根据筛选出的特异MicroRNAs序列，构建其干预载体，转染SMMC‑7721、MHCC‑97H、WRL‑68、HSC、ECV304，转染48h后，收集细胞及上清，提取总RNA，利用real‑timePCR技术检测转染后不同细胞系miR‑21、miR‑26a、miR‑199a‑3p、miR‑122、miR‑151、miR‑221的表达，确定所构建载体的有效性，同时比较转染后各MicroRNA在胞内和上清中含量的变化；S3、将特异MicroRNAs干预载体、PTEN干预载体分别转染HSC和ECV304，转染48h后收集细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound‑healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；S4、将特异MicroRNAs干预载体、PTEN干预载体分别转染SMMC‑7721和MHCC‑97H，48h后收集细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound‑healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；WesternBlot和免疫荧光标记检测EMT指标，包括上皮细胞表型指标和间质细胞表型指标；S5、用特异MicroRNAs的干预载体转染SMMC‑7721和MHCC‑97H，48h后收集其上清，用于培养HSC和ECV304；继续培养48h后收集HSC和ECV304细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound‑healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；S6、用特异MicroRNAs的干预载体转染SMMC‑7721和MHCC‑97H，与HSC和ECV304在transwell板中一起培养；继续培养48h后收集HSC和ECV304细胞，WesternBlot和免疫荧光标记检测PTEN/PI3K/AKT、EGFR、VEGFR、Ras/ERK和STATs等信号的表达和定位；MTT和wound‑healing实验观察细胞的增殖、迁移能力的变化；S7、收集肝癌骨转移临床标本，采用qRT‑PCR、免疫荧光、免疫组化方法检测MicroRNAs、信号蛋白分子的表达，分析验证肝癌骨转移组织中癌细胞和间质细胞的形态、表型特征、间质血管密度及其与MicroRNAs相关性；S8、将肝癌细胞MHCC‑97H皮下注射入腹腔和肝内，模拟癌转移，建立小鼠肝癌转移模型；以携带miR‑21反义序列和PTEN过表达腺病毒载体，通过裸鼠腹腔和肝内注射，干预癌细胞和间质细胞MicroRNAs及其下游靶基因表达；通过小动物活体成像技术观察肿瘤结节的分布、大小、数量及转移情况；取肿瘤结节或转移灶，采用realtime‑PCR、WesternBlot、免疫荧光、免疫组化等方法，检测癌细胞和间质细胞MicroRNAs、信号蛋白分子的表达；CD31抗体标记间质血管，计数间质微血管数量，观察干预MicroRNAs表达及抑制信号通路活性是否对肿瘤细胞生长、侵袭、转移产生抑制作用。