[发明专利]一种鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的扩增方法在审
| 申请号： | 201910235222.4 | 申请日： | 2019-03-27 |
| 公开（公告）号： | CN109929835A | 公开（公告）日： | 2019-06-25 |
| 发明（设计）人： | 叶传涛;雷迎峰;贾战生;边培育;张静;董阳超;王媛;徐志凯 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第四军医大学 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 西安文盛专利代理有限公司 61100 | 代理人： | 彭冬英 |
| 地址： | 710032 *** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种鼠单克隆抗体轻链可变区基因的扩增方法，根据内源性非功能轻链CDR3区特异性引物进行第一轮反转录，反应结束后使用RNase H降解RNA‑cDNA嵌合体中的RNA。再以上述第一轮反转录产物使用恒定区特异引物进行第二轮反转录，反应产物同样使用RNase H处理，获得含有功能轻链转录本的cDNA。最后用前导区及恒定区引物对第二轮反转录制备的cDNA进行PCR扩增，即获得功能性轻链可变区基因。本发明提供了简单、快速、高效的从杂交瘤细胞中扩增鼠单克隆抗体轻链可变区序列的方法。本发明降低杂交瘤细胞cDNA中完整的内源性非功能轻链可变区反转录产物含量，增加终产物中功能性轻链可变区比例。 | ||
| 搜索关键词： | 轻链可变区基因 鼠单克隆抗体 反转录 扩增 反转录产物 轻链可变区 杂交瘤细胞 内源性 轻链可变区序列 恒定区引物 轻链CDR3区 特异性引物 前导 特异引物 恒定区 嵌合体 终产物 转录本 降解 轻链 制备 | ||
【主权项】：
1.鼠单克隆抗体轻链可变区扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：⑴杂交瘤细胞总RNA提取；⑵第一轮反转录反应制备cDNA：在第一轮反转录反应中，使用内源性非功能轻链CDR3区特异性引物进行反转录，反应结束后使用RNase H对反应产物中RNA‑DNA嵌合体的RNA链进行降解，以去除RNA模板中内源性非功能轻链可变区转录本；⑶第二轮反转录反应制备cDNA：在第二轮反转录反应中，以第一轮产物为模板，以鼠单克隆抗体轻链恒定区特异性引物进行反转录，反应结束后使用RNase H降解RNA‑DNA嵌合体的RNA链；⑷鼠单克隆抗体轻链可变区扩增：最后使用前导区及恒定区引物进行PCR扩增功能轻链可变区序列。
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