[发明专利]一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法

摘要

本发明公开了一种亚洲棉原生质体分离与外源基因转化的方法。该方法包括亚洲棉种子萌发、酶解分离原生质体、离心收集原生质体、培养、外源基因转化及显微观察鉴定等步骤。本发明黑暗环境中生长的叶片所分离的原生质体浓度符合实验需求且完整度高，可得到完整的转化成功的原生质体。因此本发明得出的利用黑暗环境培养的叶片分离原生质体方法，更好地解决了亚洲棉原生质体分离及外源基因转化的难题。亚洲棉原生质体分离及外源基因成功转化，可为开展亚洲棉大规模细胞培养、有目的地导入外源基因及进一步创新和品质改良工作提供基础帮助。

主权项

1.一种亚洲棉原生质体的分离与外源基因转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取饱满的亚洲棉种子，黑暗环境下萌发生长；(2)取步骤(1)生长至8‑10天的子叶，切成细条放入酶解液中，抽真空，然后将酶解液及子叶转移至无菌锥形瓶中，黑暗培养10‑16h；(3)向步骤(2)处理后的酶解液内加入等体积预冷的W5溶液后轻轻摇晃，释放原生质体，低速离心，弃上清；(4)向步骤(3)中保留溶液内加入预冷的W5溶液重新悬浮原生质体，低速离心，弃上清，加入适量W5溶液重新悬浮收集原生质体；(5)将步骤(4)中原生质体放在冰上静置30min，弃上清液加入预冷的Mmg溶液重新悬浮原生质体，并通过细胞计数板计数；(6)将步骤(5)中原生质体装至圆底离心管，加入载体；轻轻混匀，再加入等体积的40％PEG‑Ca²⁺溶液，轻轻上下颠倒混匀，室温静置18min后加入两倍体积的W5溶液终止转化；(7)将步骤(6)中的混合物低速离心后吸去40％PEG‑Ca²⁺溶液，加入等体积W5溶液，低速离心，去上清液，然后加入等体积W5溶液，再次低速离心后吸去W5溶液，加入等体积WI溶液，轻轻混匀，低速离心；然后转移至培养板孔中，25℃恒温黑暗培养14‑16h。