[发明专利]不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系

摘要

本发明公开了不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系。本发明提供了一种利用甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子的方法，包括如下步骤：1)酶解甘蓝型油菜叶片制备得到原生质体；2)将外源核酸分子转入所述原生质体，得到转外源核酸分子的原生质体；再将所述转外源核酸分子的原生质体在C:B培养基中分裂培养，得到由原生质体分裂形成的细胞团；本发明以油菜无菌幼苗为起始材料，采用纤维素酶R‑10和离析酶R‑10，对油菜叶肉组织进行消化并利用密度梯度沉降的方法分离原生质体，获得了高纯度的原生质体。通过聚二乙醇介导将目的基因导入油菜原生质体基因组中，经液体浅层培养以及后续分化再生，培育出大量油菜转基因植株。

主权项

1.一种利用甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子的方法，包括如下步骤：1)酶解甘蓝型油菜叶片制备得到原生质体；2)将外源核酸分子转入所述原生质体，得到转外源核酸分子的原生质体；再将所述转外源核酸分子的原生质体在C:B培养基中分裂培养，得到由原生质体分裂形成的细胞团；所述C:B固体培养基为将C液体培养基和B液体培养基等体积混合，再加入凝固剂，得到C:B固体培养基；所述C液体培养基包括2‑3g/L KNO₃、0.2‑0.3g/LNH₄NO₃、0.5‑1g/L CaCl₂·2H₂O、0.2‑0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.2‑0.3g/L(NH₄)₂SO₄、0.1‑0.2g/L NaH₂PO₄·H₂O、0.01‑0.1g/L CaHPO₄、5‑15mL/L MS微量100×母液、0.5‑1.5mL/L铁盐1000×母液、50‑150mg/L肌醇、0.5‑0.15mg/L VB₁、0.1‑1mg/L VB₆、0.1‑1mg/L烟酸、1‑3mg/L甘氨酸、300‑500mg/L水解酪蛋白、20‑40g/L蔗糖、40‑50g/L山梨醇、40‑50g/L甘露醇、1‑2mg/L2，4‑二氯苯氧乙酸、5‑6mg/L1M KOH水溶液；所述B液体培养基包括1.5‑2g/L KNO₃、0.5‑1g/LNH₄NO₃、0.5‑1g/L CaCl₂·2H₂O、0.1‑0.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.1‑0.2g/L KH₂PO₄、5‑15mL/L MS微量100×母液、0.5‑1.5mL/L铁盐1000×母液、50‑150mg/L肌醇、0.5‑0.15mg/L VB₁、0.1‑1mg/L VB₆、0.1‑1mg/L烟酸、1‑3mg/L甘氨酸、300‑500mg/L水解酪蛋白、20‑40g/L蔗糖、1‑10mg/L2，4‑二氯苯氧乙酸、5‑6mg/L1M KOH水溶液；3)将所述细胞团在含有潮霉素的A液体培养基中诱导培养，得到愈伤组织；所述含有潮霉素的A液体培养基由潮霉素和A液体培养基组成；所述A液体培养基包括0.5‑1.5g/L KNO₃、0.5‑1g/LNH₄NO₃、0.2‑0.5g/L CaCl₂·2H₂O、0.5‑1g/L MgSO₄·7H₂O、0.1‑0.2g/L KH₂PO₄、0.01‑0.1g/L琥珀酸铵、5‑15mL/L MS微量100×母液、0.5‑1.5mL/L铁盐1000×母液、50‑150mg/L肌醇、0.5‑0.15mg/L VB₁、0.1‑1mg/L VB₆、0.1‑1mg/L烟酸、1‑3mg/L甘氨酸、300‑500mg/L水解酪蛋白、20‑40g/L蔗糖、1‑3mg/L2，4‑二氯苯氧乙酸、5‑6mg/L1M KOH水溶液；4)将所述愈伤组织在MS固体再生培养基上分化培养，得到分化出丛生芽的愈伤组织；所述MS固体再生培养基包括2‑3g/L KNO₃、1‑2g/LNH₄NO₃、0.5‑1g/L CaCl₂·2H₂O、0.1‑0.5g/L MgSO₄·7H₂O、0.1‑0.2g/L KH₂PO₄、5‑15mL/L MS微量100×母液、0.5‑1.5mL/L铁盐1000×母液、50‑150mg/L肌醇、0.05‑0.2mg/L VB₁、0.1‑1mg/L VB₆、0.05‑0.2mg/L烟酸、1‑3mg/L甘氨酸、20‑40g/L蔗糖、0.1‑0.3mg/L激动素、5‑6mg/L1M KOH水溶液；5)将所述分化出丛生芽的愈伤组织进行生根培养，得到幼苗，实现甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子。