[发明专利]一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，提供一种按常规表达方法较难溶蛋白质Pl101的表达、纯化方法及其纯蛋白的应用。表达方法是选用pMAL表达载体，通过连接麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein，MBP）标签增加目标蛋白的溶解性，进而表达出可溶解重组蛋白。通过亲和层析纯化的方法获得重组纯蛋白MBP‑Pl101，蛋白酶切除麦芽糖结合蛋白标签，获得可溶性纯蛋白Pl101。对纯蛋白进行酶活测定及结晶性实验，结果表明经此方法表达、纯化出的纯蛋白Pl101具较高酶活性及结晶性。本发明方法快速、简便、有效地获得具生物学活性的目标蛋白，缩短了纯化流程，降低了纯化成本，为难溶蛋白尤其是有结晶等下游操作需求的蛋白表达、纯化提供了技术借鉴。

主权项

1.一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用，包括：一种难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法及其应用，其特征在于，难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法包括有下列步骤：A：将按常规方法表达为难溶蛋白的靶基因Pl101构建pMAL‑p4X原核表达体系，转化大肠杆菌（表达菌株E. coli BL21 (DE3) pLysS）诱导表达出融合蛋白MBP‑Pl101，确定的融合蛋白MBP‑Pl101诱导表达条件为：诱导温度16℃，诱导剂IPTG终浓度为1mM/L，诱导时间16h；融合蛋白含一个编码麦芽糖MBP（分子量约42kDa）的malE标签基因，为亲和层析所用；B：实验证明表达出的融合蛋白MBP‑Pl101在常规缓冲液A（10mM Tris‑HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β‑巯基乙醇）中即可溶，选用淀粉树脂（Amylose Resin）凝胶介质进行亲和层析纯化，并对洗杂液、洗脱液进行不同条件的优化，经实验确定的两种洗杂液分别为缓冲液B（10mM Tris‑HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β‑巯基乙醇，0.5%(v/v)吐温‑20）、C（10mM Tris‑HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β‑巯基乙醇，1%(v/v) triton‑100），洗脱液为缓冲液D（110mM Tris‑HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β‑巯基乙醇，10mM麦芽糖），洗脱获得重组纯蛋白MBP‑Pl101；C：重组纯蛋白MBP‑Pl101用人鼻病毒3C蛋白酶（目标蛋白与酶质量比50：1）将亲和标签麦芽糖结合蛋白MBP切除获得Pl101纯蛋白，纯蛋白经透析袋4℃低温透析的方法将最终缓冲液替换为缓冲液A（10mM Tris‑HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β‑巯基乙醇），Pl101纯蛋白经Western blotting杂交验证。