[发明专利]一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法

摘要

本发明属于食品检测技术领域；具体检测方法如下：提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA、分别检测提取的标准样品DNA和待测样品DNA羊肉样品DNA浓度、对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记、利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果、毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型、构建STR‑SSR标准分型峰值谱图；本发明用于特异性地鉴别出滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊，该方法耗时短,操作简便,特异性强,采用峰值谱图对检测结果进行比对，检测结果能互相验证,可以用于无法从形态学上加以识别的三种近缘绵羊物种的精确鉴定，有利于滩羊产业的持续健康发展和消费者权益。

主权项

1.一种基于物种特异性STR‑SSR的近缘绵羊肉检测方法，其特征在于：具体检测方法如下：第一步：提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA：分别取25～50只滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊的肌肉组织分别研磨成粉末，分别加到离心管中，加入细胞裂解液，离心处理至样品完全裂解，待用，其中提取的滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊羊肉样品DNA为标准样品DNA；再次分别提取滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊共计324只绵羊肉样品DNA，记为待测样品DNA；第二步：分别检测提取的标准样品DNA和待测样品DNA羊肉样品DNA浓度：分别提取第一步中裂解后的标准样品DNA和待测样品DNA各1‑5μL分别加入微量核酸蛋白浓度测定仪测定提取的DNA的纯度；第三步：对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记：采用MISA软件对上述第一步中提取的标准样品DNA和待测样品DNA进行SSR序列检测，分别选取标准样品DNA和待测样品DNA中的SSR基因序列，采用Primer3对选取的SSR基因序列进行荧光标记，得到标准样品DNA的SSR基因序列荧光标记引物和待测样品DNA的SSR基因序列荧光标记引物；第四步：利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增：提取第一步中裂解后的标准样品DNA和待测样品DNA各0.5‑1.5μg，分别向其中加入2×TaqPlusMasterMix10‑15μL、第三步已合成的SSR基因序列荧光标记引物、上游引物0.3‑0.8μL、下游引物0.3‑0.8μL、，并且通过ddH₂O定容至25μL，将制得的PCR反应体系进行PCR扩增；第五步：琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：称取1％琼脂糖溶液制为琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中向其中加入1×TAE电泳缓冲，分别将第四步PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列均匀点样在琼脂糖凝胶中，将琼脂糖凝胶置于电泳检测仪上进行成像分析，检测标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的PCR扩增情况；第六步：毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型：采用3730xl设备分别检测PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图；第七步：构建STR‑SSR标准分型峰值谱图；根据第六步检测的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图峰形图，将待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的峰形位置和峰值大小确定与标准样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的峰形位置和峰值大小判断待测羊肉的种类。