[发明专利]不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素Ⅱ的表达试验方法

摘要

本发明公开了不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，实验材料包括6只健康的12月龄绵羊，实验包括如下步骤：试验动物及样品采集；试验试剂的配制；白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取；白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定；SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育；不同毛色绵羊皮肤组织的包埋及切片制作；不同毛色绵羊皮肤组织的免疫组织化学方法；数据处理与统计分析。本发明采用免疫组织化学法对白色和黑色绵羊皮肤中AngII进行定位，免疫组织化学结果显示，AngII蛋白在黑色绵羊毛囊中真皮乳头和外根鞘部的表达量均高于白色皮肤，因此，验证了AngII蛋白参与绵羊被毛颜色的形成，为研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色的形成中的作用提供了理论依据。

主权项

1.不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，实验材料包括6只健康的12月龄绵羊，实验包括如下步骤：S1：试验动物及样品采集将每只绵羊后臀部的被毛剪掉，并用剃毛刀小心刮净表皮，后用取皮器取绵羊皮肤样品快速放入液氮，用于下一步的试验；另取皮肤样品分别置于4％多聚甲醛固定液中，24h后，将固定的样品转移到70％的酒精溶液中，用于后续的试验；S2：试验试剂的配制配置电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBST缓冲液、5％的封闭液、4％浓缩胶、10％分离胶和12％分离胶；S3：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取将液氮中的绵羊皮肤组织置于研钵中充分研磨；称量研磨好的组织，根据重量加入500‑1,000μL的组织提取裂解液，用力震荡后，将EP管置于冰上，充分裂解组织；约1h后，用4℃离心机以12,000r·min^‑1离心5min后，小心吸取上清液，分装于新的EP管中，存放于‑20℃；S4：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的总蛋白的浓度；S5：SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育配制10％的分离胶和4％的浓缩胶；根据每个样品的蛋白浓度，计算各样品的上样量，并加入5×Loading buffer，95℃，10min蛋白变性；将变性好的样品溶液和蛋白Marker加入孔中，进行SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V电压跑至分离胶和浓缩胶的交界处，再换用120V电压跑至溴酚蓝到达距离分离胶底部约1cm处；100V恒压转膜1.5h；将标记好的NC膜放入封闭液中脱色摇床上封闭1h；用TBST稀释兔抗AngII多克隆抗体(1∶300)，4℃孵育，过夜；将NC膜放入二抗(1∶5,000)中，在37℃恒温摇床中孵育1h；二抗孵育结束后，将NC膜取出，用TBST洗10min×3次；待清洗完毕后，将NC膜放置于展开的保鲜膜上，将配制好的ECL发光液覆盖于整个膜上进行显定影，扫描采集图片；S6：不同毛色绵羊皮肤组织的包埋及切片制作用取皮器取绵羊背部皮肤组织，用镊子将组织样品摊平，小心将其放入4％多聚甲醛固定液中，组织样品固定24h；将皮肤样品进行梯度脱水；S7：不同毛色绵羊皮肤组织的免疫组织化学方法提前将切好的片子放入烘箱，37℃恒温烘4‑5h；切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水处理；用枸橼酸盐缓冲液对切片组织进行抗原热修复10min，PBS洗5min×2次；在组织样品上滴加适量的3％H₂O₂，37℃恒温孵育10min，PBS洗3次，每次3min，将组织切片放置在保湿盒中，滴加适量的封闭液，室温孵育30min；滴加一抗(1∶50)，4℃过夜，用PBS做阴性对照；从4℃取出后，放置在37℃的烘箱中，孵育30min；滴加适量的二抗，37℃恒温孵育30min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃恒温孵育20min；滴加配制好的DAB显色试剂；用苏木精进行轻度复染，复染时间为10min；梯度酒精脱水和二甲苯透明处理，中性树脂封片处理；显微镜下观察，阳性为棕黄色，分别获取组织样品的阳性、阴性图像；S8：数据处理与统计分析所有数据使用SPSS 17.0软件进行分析，统计分析基于ANOVA，Duncan方法进行多重比较，使用SigmaPlot 12.5对数据转换成图表处理，结果用平均值±标准误差表示，Image Pro Plus 7.0图像分析软件用于处理免疫组织化学结果。