[发明专利]一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用，所述构建方法通过增加用于反转录的起始总RNA量，无需使用PCR扩增步骤，从而可以减少冗余序列的产生；使用新的终载体质粒pSPR3na，后续可一步生成次级文库并可以多次生成；本发明所述构建方法可以实现降低酵母文库序列冗余度并可以反复生成次级文库的目的。本发明还公开了所述膜系统表达文库在进行膜蛋白‑膜蛋白、膜蛋白‑可溶性蛋白间的互作研究，用于表达文库的筛选，用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的研究中的应用。本发明还公开了一种新的酵母文库终载体质粒。

主权项

1.一种膜系统表达文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：(1)分离mRNA；(2)反转录及二链合成；(3)cDNA连接接头；(4)连接接头的cDNA进行分级分离；(5)将步骤(4)获得的cDNA与pDONR222质粒进行BP重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，经培养得到初级文库；(6)检测所述初级文库；(7)制备初级文库质粒：培养经步骤(6)检测合格的初级文库，抽提质粒即得到初级文库质粒；(8)将步骤(7)得到的初级文库质粒与载体pSPR3na进行LR Clonase II重组酶重组，得到最终次级文库，即所述膜系统表达文库；其中，所述载体pSPR3na的构建步骤为：在pPR3‑N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列所生成的质粒；其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列包含CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG两段attr重组序列、以及一段ccDB致死基因序列，其中所述两段attr重组序列连接在所述ccDB致死基因序列的两端。