[发明专利]人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用，属于分子生物学及基因工程领域。将人博卡病毒的ITR区序列分为5个片段，分段连接到去除B19基因、添加多克隆位点的pB19‑4244d载体上，得到人博卡病毒1型感染性克隆。本发明的人博卡病毒1型感染性克隆，可用于制备基因治疗载体。酶切去除人博卡病毒1型感染性克隆的人博卡病毒基因1505nt‑4138nt，插入含启动子、外源基因的DNA片段，获得基因治疗载体。本发明构建的人博卡病毒1型感染性克隆可在细胞上有效复制，构建的人博卡病毒基因治疗载体可表达外源蛋白并对肿瘤细胞有杀伤效应。

主权项

1.一种人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：(1)将pB19‑4244d载体用Sal I酶切去除B19基因后再连接，得到Z‑4244d载体；(2)将含Sal I和Xho I粘性末端、序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段1与Sal I单酶切的Z‑4244d载体片段进行连接，得到Z‑4244d2载体；(3)用Sal I和Hind III酶切序列SEQ ID NO.2所示的DNA片段2和Z‑4244d2载体，连接，得到Z‑4244d2‑2载体；用Sal I、Bcl I双酶切序列SEQ ID NO.3所示的DNA片段3，连接到经Sal I、Bgl II双酶切的Z‑4244d2‑2载体上得到Z‑4244d2‑2‑3载体；(5)用Sal I、Apa I酶切序列SEQ ID NO.4所示的DNA片段4和Z‑4244d2载体，连接，得到Z‑4244d2‑4载体；用Apa I、Xho I酶切序列SEQ ID NO.5所示的DNA片段5和Z‑4244d2‑4载体，连接，得到Z‑4244d2‑4‑5载体；用Kas I酶切序列SEQ ID NO.6所示的DNA片段6和Z‑4244d2‑4‑5载体，连接，得到Z‑4244d2‑4‑5‑6载体；(6)将Z‑4244d2‑2‑3载体用Sal I、Xho I双酶切，连接到经Sal I单酶切的Z‑4244d2‑4‑5‑6载体上，得到Z‑4244d2‑2‑3‑4‑5‑6载体；PCR扩增含HBoV1基因组编码区nt518‑4139的片段，将该片段与Z‑4244d2‑2‑3‑4‑5‑6载体用BspE I、Bgl II双酶切后，连接，得到人博卡病毒感染性克隆pIHBoV1。