[发明专利]基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法

摘要

本发明提供了基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的adgrf3b基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA和Cas9‑mRNA，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养36小时后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性；本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中敲除特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因；且干扰掉adgrf3b基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示肠道及其上皮细胞形态发生的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上肠道相关疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

主权项

1.基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计和PCR检测引物在NCBI数据库上查询斑马鱼adgrf3b基因的基因组DNA序列，在SMART网站上分析功能结构域，在The ZiFiT Targeter网站上设计斑马鱼adgrf3b基因的靶位点，位于基因组的第十号外显子上；两对特异性靶位点PCR引物如下：F1(靶位点a正向引物)：GCGTAATACGACTCACTATAGGAACGTCTCAGAAGAGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGF2(靶位点b正向引物)：GCGTAATACGACTCACTATAGGGCATGCTTATTGGGTACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGR(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACTPCR检测引物PCR检测引物上下游引物分别位于adgrf3b第十号外显子上：F(5’‑GTATCCAGCACAGTTGAGAAC‑3’)R(5’‑GACCAGACCAAGAACTCAATG‑3；通用模板序列为：TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTT步骤二：PCR产物进行基因特异性gRNA体外合成2.1)以合成的DNA为模板，通过特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA；正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子20pb靶序列20bp gRNA上游骨架，反向引物R：20bp gRNA下游骨架，PCR反应体系如下：震荡均匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；2.2)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；2.3)测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA，体系如下：体外转录反应体系：将反应物全部加入0.2mL EP管中，混匀之后，于37℃水浴2h；水浴结束后，消化DNA模板，然后电泳；2.4)特异性gRNA的纯化用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于‑20℃；进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并用Nano drop测定纯化之后的gRNA浓度；步骤三：斑马鱼胚胎的显微注射在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中，在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 mRNA的终浓度为150ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射约1.0nL Cas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内；注射过的受精卵放置于E3水中，28.5℃孵化；在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；显微注射体系如下：步骤四：Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其adgrf3b基因是否存在突变；4.1)提取斑马鱼基因组斑马鱼胚胎受精36小时后(36hpf)，分别收集野生型和注射后胚胎于1.5mL Ep管中，每管2颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：向装有胚胎的Ep管中加入200μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴锅中裂解过夜；裂解完成后，放在震荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000×g离心10min，倒掉上清液；加入75％乙醇500μL，于4℃条件下，12000×g离心5min，弃上清液，室温风干20min；加入60μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率；4.2)PCR扩增目的序列提取基因组DNA后，根据CRISPR靶位点上下游约150‑200bp的基因组区域，利用Primer Premier5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；PCR反应体系如下：震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；4.3)用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，野生型基因组进行PCR扩增会出现320bp的条带，基因敲除后的PCR产物会出现320bp的野生型条带以及186bp的基因敲除条带，在紫外下切186bp的基因敲除下目的条带，进行纯化回收；4.4)送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；4.5)注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；步骤五：目的序列的TA克隆PCR初步鉴定有大片段缺失目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；步骤六：质粒的Sanger测序将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；步骤七：获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28.5℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出320bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，PCR会出现一条186bp左右的小带，如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现186bp的小带；如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2‑3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体；步骤八：获得斑马鱼突变体的F2代纯合子从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28.5℃培养，受精2两天后取部分胚胎进行鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出186bp靶位点附近区域，通过PCR扩增分析并测序，初步检验是否可以得到adgrf3b突变体纯合子；挑选检验结果证明存在纯合子，养大后再单条剪尾鉴定；步骤九：重复步骤八，可进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到这种新的斑马鱼品系。