[发明专利]一种牛肉中肌红蛋白的提取方法

摘要

本发明提供了一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，该方法为向牛肉肉样中加入Tris‑HCl混合缓冲液、匀浆、静置、离心，加入(NH₄)₂SO₄静置、离心后，加Tris‑HCl缓冲液b后透析，在层析柱中用NaCl混合溶液洗脱得到牛肉中肌红蛋白。本发明优化Tris‑HCl混合缓冲液pH值、提取时间、肌红蛋白盐析液饱和度提高肌红蛋白的提取量；本发明Tris‑HCl混合缓冲液中含甘油和二硫苏糖醇，甘油维持肌红蛋白结构稳定性，利于快速沉淀析出，二硫苏糖醇保持肌红蛋白的还原性与生物活性，加固体(NH₄)₂SO₄盐析分级沉淀，提高肌红蛋白纯度，4℃进行防止肌红蛋白变性氧化，透析可有效去除残留的盐离子和他小分子蛋白质，提高肌红蛋白的纯度，最后进行凝胶过滤层析分离，不破坏肌红蛋白的结构与功能。

主权项

1.一种牛肉中肌红蛋白的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、粗提：取牛肉背最长肌，去除表面筋膜及结缔组织，切碎得到牛肉肉样，向牛肉肉样加入浓度为10mmol/L、pH值为8.0～8.4的Tris‑HCl混合缓冲液，然后在转速为10000rpm的条件下匀浆1min后，在温度为4℃的条件下静置提取1h～2h，然后在转速为9600rpm、温度为4℃的条件下离心10min后过滤，得到滤液；所述Tris‑HCl混合缓冲液中含有浓度为10mmol/L的Tris‑HCl缓冲液a、1mmol/L的EDTA、0.54mmol/L的甘油和1mmol/L的二硫苏糖醇；步骤二、盐析：向步骤一中得到的滤液中边搅拌边缓慢均匀加入固体(NH₄)₂SO₄，得到肌红蛋白盐析液，当肌红蛋白盐析液的饱和度为85％～95％时，在温度为4℃的条件下静置30min沉淀蛋白质，然后在转速为10000rpm、温度为4℃的条件下离心30min，得到肌红蛋白沉淀物；步骤三、透析：向步骤二中得到的肌红蛋白沉淀物中加入浓度为10mmol/L、pH值为8.5的Tris‑HCl缓冲液b搅拌溶解后，置于截留分子量为8kDa～14kDa的透析袋中，加入浓度为10mmol/L、pH值为8.5的Tris‑HCl缓冲液c在温度为0℃～4℃的条件下搅拌并透析24h，透析过程中所述Tris‑HCl缓冲液b置换10次，得到高纯度肌红蛋白；步骤四、凝胶过滤层析：将Sephadex G‑75层析柱用浓度为1mmol/L、pH值为8.5的Tris‑HCl缓冲液d平衡后，用浓度为0.1mol/L的NaCl混合溶液对步骤三中得到的高纯度肌红蛋白进行线性洗脱，流速为2mL/min，连续收集多管洗脱液至洗脱完毕，每管洗脱液均在波长为280nm的紫外光下进行检测，合并洗脱峰吸收值最大的洗脱液，得到牛肉中肌红蛋白；所述NaCl混合溶液含有浓度为0.1mol/L的NaCl、1mmol/L的EDTA和10mmol/L的Tris‑HCl缓冲液e。