[发明专利]小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法

摘要

本发明提供小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法，该方法仅需对小麦远缘杂交衍生的小片段易位系及其小麦受体和野生近缘种供体三个样品进行转录组测序，结合生物信息学分析、比较基因组学和功能标记开发验证，可实现从小麦远缘杂交衍生系中快速挖掘外源功能候选基因。本发明不依赖小麦近缘植物的参考基因组序列，实现了低成本且高效地筛选功能候选基因，为功能基因的克隆奠定基础。

主权项

1.小麦远缘杂交后代小片段易位系中发掘外源功能候选基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、小麦近缘植物的全长转录组测序：获取小麦近缘植物多个组织且包含所研究的目的性状发生前和发生时的组织，分别提取各个组织mRNA且等量混合；为了获得小麦近缘植物的全长转录组参考序列，利用第三代测序技术和平台对混合样品进行全长转录组的建库和测序；B、小麦远缘杂交后代小片段易位系和小麦受体的转录组测序：分别获取小麦远缘杂交后代小片段易位系和小麦受体植株多个组织且包含所研究的目的性状发生前和发生时的组织，分别提取各个组织mRNA且等量混合；为了对转录本的表达进行定量，利用第二代测序技术和平台对各自的混合样品进行高通量转录组的建库和测序，分别得到小麦受体和易位系的转录本测序数据；C、易位系中外源染色体片段中特异表达转录本分析：对小麦近缘植物的全长转录组测序数据进行生物信息学分析，获得非嵌合且全长的转录本序列，去除冗余后，与小麦参考基因组序列和注释文件进行整合作为总的参考序列；将小麦受体的转录本序列以及易位系的转录本序列分别与所述总的参考序列进行比对，并过滤，去重复，仅保留唯一比对的序列比对结果，然后统计比对到每个转录本上的序列数目，最后进行小麦受体和易位系之间转录本的序列差异表达显著性检验，根据易位系和小麦受体之间转录本的序列比对数目，使用参数log2(差异倍数)≤‑4和假阳性率<0.05进行过滤，获得易位系中外源染色体片段中特异表达的转录本，作为候选转录本序列；D、分子标记开发：将获得的候选转录本序列与小麦参考基因序列进行比对，根据比对结果找出候选转录本与小麦基因组上同源基因之间的差异，根据差异序列设计并开发分子标记及其检测引物；利用设计的引物在小麦近缘植物、小麦受体和易位系中进行PCR验证，确定所获得的外源染色体片段中特异表达的转录本的真实性；E、候选基因预测：对于步骤D中获得的真实候选转录本序列，与小麦参考基因序列进行比对，进行比较基因组学分析，构建易位系中外源染色体片段与小麦基因组间的比较基因组学图谱；对共线性候选区间内的基因进行功能注释，获得外源功能候选基因。