[发明专利]一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用，首先是获得覆盖所选冠状病毒全长基因组的cDNA小片段，然后进行分段克隆，再使用RED/ET重组技术将含有冠状病毒全长基因组的cDNA小片段组装到质粒载体上，筛选获得含有该冠状病毒全长cDNA的感染性克隆。其有益效果在于，本发明首次利用中低拷贝的质粒载体成功构建了鸡传染性支气管炎病毒感染性克隆，为冠状病毒的感染性克隆的构建开辟了新途径，该方法解决了冠状病毒载体选择困难和病毒大基因组在细菌中不稳定的问题，阳性克隆率高，且获得的反向遗传疫苗株克隆具有完整性、传代稳定性和感染性，拯救效率高，为研究冠状病毒的致病机理和开发新型疫苗等提供了有效工具。

主权项

1.一种构建冠状病毒感染性克隆方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1：提取该冠状病毒的RNA，反转录获得cDNA；S2：将步骤S1所得cDNA片段化，得到包含cDNA全基因的各片段，其中所述片段的首片段包括T7启动子，所述各片段相邻两片段间含有50～70bp重叠区域作为重组同源臂，所述片段化的方法为PCR扩增；S3：PCR扩增得到包含丁型肝炎病毒核酶序列及T7终止子的终止片段，再利用线性质粒载体分别与步骤S2中各片段连接或组装，筛选获得分别包括步骤S2中各片段的重组质粒，其中所述质粒载体包含抗性筛选基因；S4：随机选取步骤S3所得重组质粒中的一个做无义突变，得标记片段；S5：酶切或PCR扩增步骤S3和S4所得重组质粒，获得包括步骤S2中各片段和S4标记片段的片段集合，将目标质粒载体与片段集合、步骤S2的终止片段同源重组，筛选得到阳性克隆，其中，所述目标质粒载体为严紧型质粒，容量为1～60Kb，所述同源重组为RED/ET重组技术介导下的同源重组；S6：将步骤S5所得阳性克隆与辅助质粒共转染可表达T7RNA聚合酶的细胞系，能成功拯救获得该冠状病毒反向遗传株的阳性克隆即为包含该冠状病毒全基因组的感染性克隆。