[发明专利]利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法。本发明使用PCR和菌体内同源重组的机制相结合，摆脱了载体构建中对DNA酶切和连接的依赖；引入ccdB致死基因，简化了阳性克隆的筛选。本发明可用于高通量的载体构建，具有省时、省力、低成本的优点。

主权项

1.利用ccdB致死基因快速构建重组质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、PCR扩增ccdB基因表达盒子、表达载体和目的基因，得到含线性ccdB基因表达盒子的PCR产物、含线性表达载体的PCR产物和含线性目的基因的PCR产物；所用到的引物为：(1)ccdB基因表达盒子的扩增引物ccdB‑HF和ccdB‑HR；(2)载体扩增引物HF和HR；(3)扩增目的基因的引物gene‑HF和gene‑HR；b、将步骤a得到的含线性ccdB基因表达盒子的PCR产物与含线性表达载体的PCR产物混合后转入耐受ccdB蛋白的感受态细胞，在含有抗生素A和抗生素B的培养基中培养，线性ccdB基因表达盒子与线性表达载体发生同源重组，得到带ccdB基因表达盒子的环状载体；抗生素A和抗生素B不同；c、使用载体扩增引物扩增步骤b得到的带ccdB基因表达盒子的环状载体，得到含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物；d、将步骤a得到的含线性目的基因的PCR产物与步骤c得到的含有删除ccdB基因表达盒子的线性载体的PCR产物混合后转入不耐受ccdB蛋白的感受态细胞，在含有抗生素B的培养基中培养，线性目的基因与删除ccdB基因表达盒子的线性载体同源重组，得带有目的基因的环状载体；步骤a所述的ccdB基因表达盒子是含有启动子、ccdB基因和抗生素A的抗性基因的DNA分子；步骤a中ccdB基因表达盒子的扩增引物序列以及扩增目的基因的引物序列均包括2个片段：(I)能够扩增ccdB基因表达盒子或目的基因的片段，(II)能够与表达载体同源重组的片段；片段(I)位于片段(II)的3’侧；所述同源重组的片段是载体扩增引物与表达载体配对的部分或全部片段。