[发明专利]一种高通量检测8种疫霉菌的分子检测方法

摘要

本发明公开了一种高通量检测8种疫霉菌的分子检测方法。在本发明中，将LAMP技术与96孔板结合建立了一种能够同时检测8种疫霉菌的高通量检测技术。针对8种疫霉菌(寄生疫霉Phytophthora parasitica、Phytophthora tentaculata、致病疫霉Phytophthora infestans、草莓疫霉Phytophthora fragariae、辣椒疫霉Phytophthora capsici、掘氏疫霉Phytophthora drechsleri、恶疫霉Phytophthora cactorum、大雄疫霉Phytophthora megasperma)的同一个靶标基因Ypt1建立了Ypt1‑LAMP检测引物、试剂盒和方法。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好，为疫霉菌的检测提供了高通量快速检测技术，对疫霉菌疫病防治和监测具有重要和深远意义。

主权项

1.一种高通量检测8种疫霉菌的分子检测方法，其特征在于：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用8种疫霉菌LAMP检测引物与96孔板相结合对待检微生物同时进行高通量检测；观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测结果为阳性，存在目标疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在目标疫霉菌；所述8种疫霉菌LAMP检测引物包括Phytophthora parasitica、Phytophthora tentaculata、Phytophthora infestans、Phytophthora fragariae、Phytophthora capsici、Phytophthora drechsleri、Phytophthora cactorum和Phytophthoramegasperma的LAMP检测引物，每种疫霉菌的LAMP检测引物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和正向环引物LF、反向环引物LB组成，各引物序列具体如下：Phytophthora parasitica的引物包括：F3：5′‑CTTTGTAAGTGCCACCATAC‑3′；B3：5′‑ACAGACACACACGTGATT‑3′；FIP：5′‑TCGATCGTACGGATTTTCTGCAGAAAGATCCAGGTTTTCATCAGG‑3′；BIP：5′‑AGACCATCAAGCTCCAGATTGTACGTGGTACATCGGTTAGTTGAA‑3″；LB：5′‑GACTTGTATCACTGCAGTTT‑3′；Phytophthora tentaculata的引物包括：F3：5′‑TGCCTTATAGGAATAGCGC‑3′；B3：5′‑AGCATAAGTGAATTGACCCA‑3′；FIP：5′‑ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG‑3′；BIP：5′‑TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA‑3′；LB：5′‑CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT‑3′；Phytophthora infestans的引物包括：F3：5′‑TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG‑3′；B3：5′‑GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC‑3′；FIP：5′‑AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG‑3′；BIP：5′‑TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC‑3′；LB：5′‑GGCAAGACCATCAAGCTCCAA‑3′；Phytophthora fragariae的引物包括：F3：5′‑TGAGTGCTAGTAACTAGCCT‑3′；B3：5′‑ACCAGTTAGCTCCATGAAGC‑3′；FIP：5′‑CTGTGCACAACAACGAGCACGAATTCCTAGGTCCAAAAAGGC‑3′；BIP：5′‑AATTCGCACGATCGAGCTGGATTAGCCGGCGAAATGTTCC‑3′；LF：5′‑CAGCAATCGGAGAGCAAATCTTA‑3′；LB：5′‑CGGCAAGACTATCAAGCTCCAGA‑3′；Phytophthora capsici的引物包括：F3：5′‑CTCTGTTGTATAGCAGAGGT‑3′；B3：5′‑GCACAAGACAATTAGCACAAT‑3′；FIP：5′‑TTCTGGGCGCGTACACAAACTTAGTGAGGGACAATTTATATCAGG‑3′；BIP：5′‑GATCGAGTTGGACGGCAAGATCCAGTGCTCTAACTAAAACG‑3′；LB：5′‑CCATCAAGCTCCAGATTGTAAGC‑3′；Phytophthora drechsleri的引物包括：F3：5′‑GTGATCCTTTCACCCTGG‑3′；B3：5′‑TTACAAATGTCAGCTGGATG‑3′；FIP：5′‑CGGATTTTCTAGAACGTGGTACCAAAATGAAGAGTCGACTCTAGCA‑3′；BIP：5′‑ACTATTGAGCTGGACGGCAATCGATAGCAGCCCAAGAG‑3′；LB：5′‑TGTACGTCTACAGAGGATTTGGAT‑3′；Phytophthora cactorum的引物包括：F3：5′‑TTCTGCGCTAGGCGACC‑3′；B3：5′‑CACACAAGTGGACCGTTAG‑3′；FIP：5′‑TCTGGGCACAACCGCAAAAATTTGCGAGCTCCAGATTTCC‑3′；BIP：5′‑AATCCGTACGATCGAGCTGGACACACGCCACGTCTGCT‑3′；LB：5′‑GGAAAGACCATCAAGCTCCAGAT‑3′；Phytophthora megasperma的引物包括：F3：5′‑GCTCTGCTCTTCCGACTTG‑3′；B3：5′‑GTTAGTTTCGTCCACGGCA‑3′；FIP：5′‑CGGGCAAGAGCAACGTCAGTGTCCCATTGTGGTCCAGTAC‑3′；BIP：5′‑TCCGTACGATCGAGCTGGACGAGAAGAAAGGAATGGAGGCC‑3′；LB：5′‑GCAAGACCATCAAGCTCCAGATTG‑3′。