[发明专利]盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法

摘要

本发明公开了盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，根据实验室获得的转录组分析结果及其他植物已报道的内参基因序列信息，初步筛选表达相对较为稳定的14个候选内参基因，其基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V‑H+‑ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；针对上述候选基因，设计相应扩增引物，并进行内参基因的筛选，本发明筛选了10个在碱蓬基因表达谱中稳定表达的基因，以其作为碱蓬盐胁迫内参基因，有利于提高碱蓬盐胁迫条件下基因表达分析研究的稳定性和可靠性；本方法弥补了现有的单一内参基因可能导致实验结果有偏差甚至错误的不足，能够得到更为可靠的结论，对于推动分子生物学方法的改进和完善、揭示细胞分化、发育、形态发生具有重要意义。

主权项

1.盐胁迫下碱蓬稳定表达的内参基因筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1）初步筛选14个稳定的候选内参基因，其基因名分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、UBC28、EF1α、PP2A、DREB1D、TIM、V‑H⁺‑ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；针对上述候选基因，设计相应扩增引物；2）提取不同盐浓度处理的碱蓬总RNA，并测定其浓度，获得的不同盐浓度处理碱蓬总RNA反转成cDNA，并以上述获得的所有样品cDNA等核酸量混合后的总 cDNA和碱蓬gDNA作为扩增模板，并利用PCR检测引物的特异性；3）以不同盐浓度处理的碱蓬cDNA为模板，对11个候选内参基因在qRT‑PCR仪器上进行反应，上述11个候选内参基因命分别为：ACT7、ACT11、CCD1、TUA5、UPL1、PP2A、DREB1D、V‑H⁺‑ATPase、MPK6、PHT4:5、CESA1；测量方法为荧光定量PCR反应法；4）利用荧光定量PCR反应后得到的Ct值，对各候选内参基因进行稳定性分析；5）通过geNorm确定准确定量的最优内参基因数目，以0.15为阈值，通过标准化因子配对差异分析(Vn/n+1)值来判定内参基因的最合适数目；6）对碱蓬CESA基因表达量变化进行计算。