[发明专利]一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶

摘要

本发明涉及一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶，属于分子生物学领域。设计筛选出突变位点并进行定点突变，然后以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白Cot作为芽孢表面展示外源蛋白的一种蛋白载体，通过芽孢表面展示技术构建表面展示一种新型乙酰胆碱酯酶蛋白的重组芽孢。本发明通过分子对接及分子动力学模拟等技术，对黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因进行定向化改造，突变后的AChE热稳定性显著增加，并将其固定在枯草芽孢杆菌芽孢表面，可一步完成酶的表达、纯化和固定化，操作过程简捷高效，利用枯草芽孢杆菌芽孢提高了重组AChE的稳定性，且枯草芽孢杆菌属于益生菌，对人体和环境不会造成影响，对提高其利用效率具有重要的意义。

主权项

1.一种固定在枯草芽孢杆菌表面的重组乙酰胆碱酯酶，其特征在于，是由下列步骤得到的：(1)黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶基因DMache获得：由化学合成法合成DMache，如SEQ ID No.1所示；引物设计F、R：F：5'‑AGCTTCTAGAATGGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGTR：5'‑ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT以合成的DMache为模板，用上述引物扩增目的基因；(2)突变体构建：设计以下引物，使用重叠延伸PCR获得突变体：1‑F：AGCTTCTAGAGCCATCTCCTGTCGGCAGAGCAGAGT1‑R：AGATCTCCTCGCCGGAGAAGGGGGGGAAGTACTCGTAACGCTCTTGGA2‑F：TCCAAGAGCGTTACGAGTACTTCCCCCCCTTCTCCGGCGAGGAGATCT2‑R：CTCGCGTTCCGCTTGCGTTGCCTTGGGAAAAATATTGTTC3‑F：GAACAATATTTTTCCCAAGGCAACGCAAGCGGAACGCGAG3‑R：ATCCATTCGGGCCACAATGAGGTGCTTGTGCGGTGTGTAAA4‑F：TTTACACACCGCACAAGCACCTCATTGTGGCCCGAATGGAT4‑R：ATTACCCGGGTTATGGTGGTGGTGGTGGTGGGAAAACCCTT第一轮PCR：用引物1‑F和1‑R扩增出片段1、引物2‑F、2‑R扩增出片段2、引物3‑F、3‑R扩增出片段3、引物4‑F、4‑R扩增出片段4；第二轮PCR：以1‑F、2‑R为引物将片段1和片段2连接，以3‑F、4‑R为引物将片段3和片段4连接，最后再以1‑F、4‑R为引物将两个片段连接到一起，使用片段纯化试剂盒将上述PCR产物纯化，获得突变体，如SEQ ID No.2所示；(3)表面展示载体的构建及转化(i)芽孢衣壳蛋白基因的获得：设计如下三组引物：Cot b‑F：5'‑CGCGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCCTCATGGACCCGTCot b‑R：5'‑GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGGGATGATTGATCATCot g‑：5'‑CGCGGATCCAGTGTCCCTAGCTCCGAGAAAAAATCCAGCot g‑R：5'‑GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGTTTGTATTTCTTTTCot z‑F：5'‑CGCGGATCCGACTGTGACCATCCGTTAGATGACAAAGATAAAGCot z‑R：5'‑GATCTCTAGAAGGAGGTGGAAAACGACGAAGAGGAGGTGGCCATTGTGATGAT使用细菌基因组提取试剂盒提取野生型枯草芽孢杆菌168 DNA，以此为模板，扩增三种芽孢衣壳蛋白基因；(ii)将上述三种芽孢衣壳蛋白基因与载体pHT43质粒分别用限制性内切酶BamH I和Sma I进行双酶切，纯化后的各片段和pHT43分别连接构建表达载体，分别转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取质粒，分别用限制性内切酶Xba I和Sma I进行双酶切，分别与用限制性内切酶XbaI和Sma I进行双酶切的突变体连接后，分别转化至大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄青霉素的平板筛选阳性转化子，分别提取表面展示质粒备用；(iii)挑取WB800N单菌落接种于25mL GM I培养基中，30℃、180rpm过夜培养，将过夜培养的菌液按10％接种量接种于25mL新鲜的GM I中，在37℃、200rpm恒温震荡培养3.5h，按5％接种量接种于5mL GM II中，37℃、150rpm震荡培养90min，吸取1mL培养物，5000rpm室温离心5min，1/10体积上清液冲悬菌体，加入5μL表面展示质粒，混匀，37℃水浴1h，37℃培养4小时，涂在含有氯霉素抗性的平板上，37℃过夜培养；(4)枯草芽孢杆菌的孢子化在超净台内取50mL DSM培养基装入空锥形瓶内，加入0.5mL步骤(3)培养的菌液，37℃，180rpm培养72h，8000rpm离心10min收集沉淀。