[发明专利]一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法

摘要

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：样本采集接收及细胞分离，原代细胞培养，传代培养，细胞检测。本发明的有益效果在于：本发明的一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，大大缩短了细胞培养周期，快速获得了大量纯度较高、状态良好的间充质干细胞；本发明的分离和培养方法除分离了华通胶外，还剥离了两条动脉的外膜，获得的hUC‑MSCs生长状态良好，获得的P1代细胞数可达3～12.5×10⁷，流式检测表面抗体CD44⁺CD105⁺可达(99.6±0.2)％，且具有良好的成脂、成骨分化能力。

主权项

1.一种人脐带间充质干细胞分离和培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：(1)样本采集接收及细胞分离：(1.1)采集新生胎儿脐带和母血：采集新生胎儿脐带，在距脐带两末端约2‑3cm处结扎，然后将采集的所述新生胎儿脐带置于含有两性霉素B和庆大霉素储运液的脐带瓶中，连同母血一并放入4‑25℃的保温箱中保存；(1.2)将采集的所述新生胎儿脐带在22h内运达实验室；(1.3)规范接收、登记，并签署知情同意书，对母血进行HBV、HCV、CMV、TP、HIV及ALT检测；(1.4)用PBS反复冲洗所述新生胎儿脐带，去除外表皮血丝，洗出静脉中的残血；(1.5)将所述新生胎儿脐带的一端固定在解剖台上，在距离固定处1cm处用解剖刀划一条深浅适度的环形口，用解剖镊撕掉脐带的外表皮，获得华通氏胶，并剥下所述新生胎儿脐带中两条动脉的外膜；(1.6)在经过步骤(1.5)处理后的新生胎儿脐带中加入消化酶溶液进行消化反应，反应完成后加入完全培养基终止消化，获得细胞悬液；(1.7)将所述细胞悬液先过100目筛网，再过200目筛网，之后1700rpm，离心7min，弃上清，沉淀加入完全培养基悬浮；(2)原代细胞培养：将细胞接种于装有原代细胞培养液的培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，获得原代细胞；所述原代细胞培养液由基础培养基和添加物组成，所述基础培养基为DMEM/F12，所述添加物为：Ultroser G血清替代物6‑8％(v/v)、维生素80‑100μg/mL、干细胞生长因子30‑80ng/mL、氨基酸5‑15mmol/mL、微量元素100‑200mmol/L；(3)传代培养：待原代细胞的融合度达到80％以上时，将原代细胞接种于装有传代细胞培养液的培养皿中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，获得传代细胞；所述传代细胞培养液由原代细胞培养液和传代添加物组成，所述传代添加物为：丝氨酸20‑30μg/mL、甘氨酸20‑40μg/mL、生物素3‑5mmol/mL、叶酸2‑5mmol/mL、吡多醇2‑3mmol/mL、硫胺素1‑2mmol/mL、B族维生素3‑5mmol/mL；(4)细胞检测：待传代细胞的融合度达到80％以上时，可以继续传代培养；之后选取生长良好的第三代细胞经抗体孵育洗涤后进行细胞活性检测、活细胞计数及细胞流式检测。