[发明专利]一种肝脏特异性聚集巨噬细胞的转基因斑马鱼模型

摘要

本发明公开了一种肝脏特异性聚集巨噬细胞的转基因斑马鱼模型。该斑马鱼为Tg(fabp10a:il34)转基因的斑马鱼。本发明通过以下步骤实现：（1）斑马鱼养殖；（2）斑马鱼胚胎整体原位杂交和抗体染色；（3）激光扫描共聚焦荧光显微镜活体成像。本发明首次证实了在肝脏异位表达、过表达的白细胞介素34可以诱导巨噬细胞向肝脏富集，并运用活体显像技术提供了坚实而直接的证据。另外，本发明中Tg(fabp10a:il34;mpeg1:GFP)成鱼具有以下表型：①巨噬细胞数目仅特异性的在肝脏区域增高；②其他组织区域如尾部造血组织（CHT）区域巨噬细胞数目不变；③粒细胞数目不变。

主权项

1.一种肝脏特异性聚集巨噬细胞的转基因斑马鱼模型，其特征在于，包括如下步骤：（1）通过聚合酶链式反应利用野生型斑马鱼基因组DNA得到斑马鱼肝脏细胞特异性启动子——脂肪酸转运蛋白10a，同时通过聚合酶链式反应利用野生型斑马鱼cDNA得到白细胞介素34基因，将这两部分片段利用DNA连接酶分段连接进入空载pBLK‑sv40构建pBLK‑fabp10a‑il34‑sv40质粒，利用显微注射技术将此质粒注射入已标记了的转基因家系Tg (mpeg1: GFP)斑马鱼卵中，然后用白细胞介素34的RNA探针进行原位杂交技术鉴定，观察在瞬时表达情况下白细胞介素34在斑马鱼体内的特异性表达情况，在肝脏瞬时表达白细胞介素34情况下，通过抗体染色鉴定巨噬细胞在肝脏部位特意性聚集情况；（2）构建Tg (fabp10a:il34)稳定遗传的转基因家系的斑马鱼，即所述可在肝脏中特异性聚集巨噬细胞的动物模型，与Tg (mpeg1: GFP)转基因斑马鱼杂交后，利用白细胞介素34的RNA探针进行原位杂交技术鉴定，在稳定表达情况下白细胞介素34在斑马鱼体内特异性表达情况，然后在肝脏稳定表达白细胞介素34时，用抗体染色鉴定巨噬细胞在肝脏部位特意性聚集情况；（3）将Tg (fabp10a: il34; mpeg1: GFP)与已做标记的转基因家系Tg( fabp10a: dsRed)杂交，获得受精卵，用激光扫描共聚焦显微镜实时活体成像技术观察在受精后3天到3.5天内巨噬细胞向肝脏区域迁移的过程。