[发明专利]一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas PAM序列的方法和系统

摘要

本发明属于基因编辑技术领域，具体为一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas PAM序列的方法和系统。本发明方法的具体步骤如下：(1)构建包含PAM序列的质粒文库；(2)构建包含PAM序列的慢病毒文库；(3)构建包含PAM序列文库的细胞系；(4)流式分选去除荧光报告基因假阳性背景；(5)转染CRISPR/Cas至包含PAM序列文库的细胞系进行编辑；(6)流式分选出荧光报告基因阳性细胞，通过PCR构建二代测序文库；(7)生物信息学分析二代测序结果，找出能够产生基因编辑的PAM序列。本发明将快速筛选出在哺乳动物细胞中能产生基因编辑的CRISPR/Cas系统，并通过测序找出其需要的PAM序列。

主权项

1.一种在哺乳动物细胞中检测CRISPR/Cas PAM序列的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建包含PAM序列的质粒文库1)设计并合成包含gRNA靶位点和若干个兼并碱基的寡核苷酸单链PAM序列文库；gRNA靶位点由gRNA结合序列与PAM序列组成，PAM序列由2个以上碱基N串联组成，所述碱基N为碱基A、T、C或G；2)通过PCR将寡核苷酸单链PAM序列文库变为双链DNA；3)将双链DNA插入至启动子与荧光报告基因之间，启动子用于下游荧光报告基因的转录；4)提取质粒，即完成包含PAM序列的质粒文库的构建；(2)构建包含PAM序列的慢病毒文库1)将哺乳动物细胞铺板至培养皿中；2)将包含PAM序列的质粒文库与慢病毒辅助质粒共转染哺乳动物细胞；3)收集慢病毒上清，并进行浓缩；4)测定慢病毒滴度，即完成包含PAM序列的慢病毒文库的构建；(3)构建包含PAM序列文库的细胞系；(4)流式分选去除荧光报告基因假阳性背景；(5)转染Cas9蛋白和gRNA或表达Cas9蛋白和gRNA的载体至包含PAM序列文库的细胞系进行编辑；(6)流式分选出荧光报告基因阳性细胞，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，通过PCR构建二代测序文库；(7)生物信息学分析二代测序结果，找出能够产生基因编辑的PAM序列。