[发明专利]一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法

摘要

本发明提供一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法，通过游离循环肿瘤DNA的提取、TP53基因4‑8号外显子PCR扩增、进行直接测序法检测TP53突变。本发明与现有传统PCR为基础的Sanger测序方法相比灵敏度高，特异性高。与二代测序方法相比检测快速、检测成本低、本发明的方法只需要常规PCR仪等常规实验室设备即可完成检测，适用平台广。本发明用外周血血浆中的游离循环肿瘤DNA替代肿瘤组织标本DNA，从而能够实现简便、及时、动态地检测TP53基因变异情况。

主权项

1.一种检测游离循环肿瘤DNA TP53基因突变的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)游离循环肿瘤DNA的提取：经EDTANa2抗凝的外周血，室温500g离心5分钟后，取上层血浆，经PAXgene Blood ccfDNA Tubes试剂盒按照说明书提取游离循环肿瘤DNA，置于1.5ml EP管中，冻存于‑80℃，作为后续PCR的模板；(2)TP53基因4‑8号外显子PCR扩增：以步骤(1)所获得的DNA10ng作为第一轮PCR模板，配置含有特异性引物对、DNA聚合酶、PCR常规组件的PCR反应体系进行两轮巢式PCR扩增；(3)TP53基因突变检测：经两轮巢式PCR产物扩增后，取15ulPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，对阳性条带进行割胶回收，连接到pGEM T‑easy载体，4℃连接过夜后转化感受态细菌，涂布氨苄青霉素平板后经蓝白斑筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩增后进行直接测序法检测TP53突变。