[发明专利]一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法有效
| 申请号： | 201910467685.3 | 申请日： | 2019-05-30 |
| 公开（公告）号： | CN110184302B | 公开（公告）日： | 2023-02-21 |
| 发明（设计）人： | 鲁慧杰;马现永;陈卫东;邓盾;容庭;田志梅;刘志昌 | 申请（专利权）人： | 广东省农业科学院动物科学研究所 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/85;C12N9/22;C12N5/10 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 颜希文;宋静娜 |
| 地址： | 510000 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)针对SIRT1基因的第一外显子设计并合成gRNA探针，gRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其反向互补序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将退火后形成反向互补的双链gRNA探针克隆到如图2所示的pSpCas9‑2A‑PuroV2.0载体中，构建同时表达如SEQ ID NO.1所示sgRNA和Cas9蛋白的质粒；(3)将步骤(2)构建好的质粒转染到IPEC‑J2细胞；(4)从步骤(3)转染后的IPEC‑J2细胞筛选单克隆突变细胞系，得到SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系，其相比野生型细胞系，缺少了SIRT1基因第一外显子中的5个碱基。本发明首次构建SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系，筛选得到稳定的单克隆SIRT1基因敲除IPEC‑J2纯合细胞系，可作为研究仔猪肠道氧化应激的细胞模型。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 sirt1 基因 ipec j2 细胞系 构建 方法 | ||
【主权项】：
1.一种SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)针对SIRT1基因的第一外显子(开放阅读框ORF内)设计并合成gRNA探针，gRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其反向互补序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将如SEQ ID NO.1和2所示的DNA链退火后形成反向互补的双链gRNA探针克隆到如图2所示的pSpCas9‑2A‑Puro(PX459)V2.0载体中，构建同时表达如SEQ ID NO.1所示sgRNA和Cas9蛋白的质粒；(3)将步骤(2)构建好的质粒转染到IPEC‑J2细胞；(4)从步骤(3)转染后的IPEC‑J2细胞筛选单克隆突变细胞系，得到SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系，与野生型细胞系相比，缺少了SIRT1基因第一外显子中的5个碱基(5’‑GCGGC‑3’)，使SIRT1蛋白在翻译过程中发生移码突变，提前终止翻译。
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