[发明专利]一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用

摘要

本发明公开的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用。在高脂饮食小鼠制备的脂肪肝模型上，通过形态学和Western blotting方法证实硫化氢通过代谢性核受体FXR缓解脂肪肝。在293A细胞转染人His‑FXR质粒及FXR锌指结构半胱氨酸突变质粒，并给予硫化氢供体处理，通过改良生物素转换实验和锌离子荧光强度实验检测并验证FXR硫氢化修饰，并确定修饰位点，发现硫化氢可使肝脏FXR Cys138/141位点发生硫氢化修饰，增强FXR对肝脏脂质合成关键酶转录调控能力，最终减轻肝脏脂质蓄积。本发明准确得到FXR蛋白硫氢化修饰位点，为缓解非酒精性脂肪肝疾病提供了新途径。

主权项

1.一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建人His‑FXR质粒；步骤2，突变分组：将步骤1中的人His‑FXR质粒分为五组，前四组分别依次突变人His‑FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192位点，记为M1、M2、M3、M4，第五组突变人His‑FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192的全部位点，记为M1‑4；步骤3，将步骤2突变后的五组人His‑FXR质粒M1、M2、M3、M4、M1‑4，分别加入293A细胞处理24h，随后再加入100μM NaHS处理2h，得到细胞处理液；步骤4，将经步骤3处理后的细胞处理液进行胞浆胞核蛋白分离，随后采用Western blotting方法观察FXR表达情况；在步骤3收细胞前2h加入100μM NaHS，HEN Buffer收细胞并超声裂解，随后通过改良生物素转换实验检测FXR硫氢化修饰，得到初步FXR蛋白硫氢化修饰位点；步骤5，对步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点，通过锌离子荧光强度实验进行验证，确定FXR蛋白硫氢化修饰位点。