[发明专利]一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒

摘要

一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒。该方法包括利用免疫磁珠富集金黄色葡萄球菌，对富集的金黄色葡萄球菌进行DNA提取，对提取的金黄色葡萄球菌的DNA进行LAMP检测等步骤。本发明的方案，使用链霉亲和素‑生物素介导偶联的免疫磁珠，制备时间为1h，大大降低了制备免疫磁珠的时间。同时链霉亲和素与生物素间有极高的亲和力，故本发明的免疫磁珠能够与抗体和磁珠直接偶联制备的免疫磁珠相比，本发明的磁珠表面能够结合更多抗体，从而大大提高了捕获率。

主权项

1.一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1)利用免疫磁珠富集金黄色葡萄球菌:取1mL待测样品于1.5mL离心管中,投入免疫磁珠300μL混匀；垂直混匀仪上室温孵育30min后，将其置于磁力架上3min使磁珠充分吸附后，将上清液弃去，取下磁力架上的离心管，加入1mL的0.01mol/L PBS洗涤悬浮，充分混匀，然后置于磁力架上3min，使磁珠充分吸附后，弃去悬浮液，重复洗涤3次，加入1mL 0.01mol/LPBS震荡重悬磁珠，将富集得到的磁珠‑菌体复合物用于后续的DNA提取及环介导等温扩增法(LAMP)的检测；2)对富集的金黄色葡萄球菌进行DNA提取:采用市售的DNA提取试剂盒提取磁珠‑菌体复合物的DNA，其原理是基于硅胶柱纯化方式，利用试剂盒中的溶菌酶(Lysozyme)消化去除金黄色葡萄球菌的细胞壁，在裂解液和蛋白酶(Proteinase K)作用下裂解消化，DNA释放到裂解液中；加入乙醇后，转移至吸附柱(Column)中过滤，DNA被吸附至吸附柱的膜上，而蛋白质则被去除；吸附柱经洗涤后去除其他杂质，最后通过低盐缓冲液洗脱DNA，洗脱的DNA可直接用于后续的LAMP的检测；3)对提取的金黄色葡萄球菌的DNA进行LAMP检测:使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，30个循环；反应完成后，根据机器绘制的扩增曲线判断扩增结果，若出现“S”形曲线则为阳性扩增，而获得线性或稍微倾斜的扩增曲线则为阴性扩增。