[发明专利]一种腺病毒颗粒获得方法

摘要

本发明公开了一种腺病毒颗粒获得方法，具体涉及腺病毒获取领域，具体操作步骤如下：S1、pshuttle‑cmv‑hTERT穿梭质粒的构建；S2、BJ5183/p超级感受态的制备；S3、同源重组腺病毒质粒构建；S4、腺病毒颗粒收集。本发明通过pshuttle‑cmv‑hTERT穿梭质粒的构建、BJ5183/p超级感受态的制备、同源重组腺病毒质粒构建以及腺病毒颗粒收集共四个步骤，能够稳定的获取腺病毒，且每次获取的腺病毒颗粒数都能够保持稳定，相比于现有技术中腺病毒的获取，获取效率以及稳定性都得到了很大的提高。

主权项

1.一种腺病毒颗粒获得方法，其特征在于：具体操作步骤如下：S1、pshuttle‑cmv‑hTERT穿梭质粒的构建；S1.1、根据NCBI hTERT基因cDNA序列设计引物，引物包括上游引物和下游引物；S1.2、在上游引物添加HindIII酶切位点及保护碱基，在下游引物添加KpnI酶切位点保护碱基；S1.3、参照高保真DNA聚合酶Platinum Pfx DNA Polymerase说明书，采用PCR法特异性扩增hTERT基因编码序列，利用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，得到大小为3.3kb条带；S1.4、将限制性内切酶HindIII、KpnI双酶切hTERT和pshuttle‑cmv进行酶切，得到酶切产物胶，回收后使用T4连接酶连接得到连接产物，接着将连接产物加入Trans‑T1感受态细胞中将其转化，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用PmeI酶切鉴定抽提的质粒，将鉴定为阳性的质粒进行测序；S2、BJ5183/p超级感受态的制备；S2.1、采用热激法将质粒pAd‑Easy‑1转化成BJ5183感受态，然后涂氨苄霉素琼脂板，挑取单克隆；S2.2、采用Inoue方法制备含pAd‑Easy‑1的BJ5183超级感受态，命名为BJ5183/p；S3、同源重组腺病毒质粒构建；S3.1、用PmeI酶切pshuttle‑cmv‑TERT质粒使其线性化，然后采用热激法将其转化成超级感受态BJ5183/p；S3.2、涂氨苄抗性琼脂板，挑取10个菌落较小的单克隆，进行摇菌，然后使用质粒小量提取试剂盒说明书进行抽提质粒，最后用pacI酶切鉴定抽提的质粒，将重组成功质粒扩增；S4、腺病毒颗粒收集；S4.1、将生长状态好的293细胞按1:3传代；S4.2、第二天细胞生长达50％时，按FuGENE6 Transfection Reagen转染试剂盒说明书将重组质粒转染293细胞；S4.3、6‑8天后将细胞及上清反复冻融3次后离心，收集上清，再感染293细胞；S4.4、6‑8天后收集细胞上清，使用过滤器过滤，分装冻存于‑80℃冰箱。