[发明专利]一种脐带间充质干细胞的分离培养方法

摘要

本发明涉及一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：采集脐带标本；清洗脐带标本；脐带标本切片；脐带组织薄片处理；脐带组织薄片培养；消化处理；离心收集细胞；重悬接种培养；消化传代培养；细胞鉴定。本发明能够高效的分离脐带间充质干细胞，组织长出细胞的概率高，能够满足临床应用和大批量生产干细胞制品的需要；分离培养工作量小、效率高。

主权项

1.一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，包括如下步骤：步骤一，采集脐带标本；取足月分娩的断脐后的脐带10cm（厘米）放入采集瓶中，加入脐带组织保护液，于4—8℃的条件下送至实验室，采集的脐带标本必须在48小时内进行分离操作；步骤二，清洗脐带标本；先从采集瓶中取出脐带标本，浸没在75%酒精中消毒，消毒时间为20‑40秒；然后，用生理盐水冲洗脐带标本，冲洗2—3次，去除酒精残余；步骤三，脐带标本切片；先剪去脐带标本两端各1cm，取中间的5cm长度的脐带标本，沿脐带标本的横向剪成1mm（毫米）厚度的脐带组织薄片，再将每片脐带组织薄片对半剪成两片；步骤四，脐带组织薄片处理；先将对半剪成两片的脐带组织薄片置于生理盐水中，清洗干净脐带组织薄片上的血渍；步骤五，脐带组织薄片培养；将清洗干净后的脐带组织薄片均匀地贴在细胞培养皿上，并在脐带组织薄片的上面盖上玻璃片；然后，加入完全培养液，在37℃、5%CO2浓度、饱和湿度的培养箱中培养；隔4天更换一次完全培养液，并观察培养皿底和玻璃片上脐组织带薄片周围的细胞生长的情况；步骤六，消化处理；当脐带组织薄片周围的培养皿底部和玻璃片上长满大量细胞后，去除脐带组织薄片，用胰蛋白酶溶液对培养皿和玻璃片上的细胞进行消化；消化1—3分钟；步骤七，离心收集细胞；加入2ml胎牛血清终止消化，收集消化液于50ml离心管中，离心收集细胞；步骤八，重悬接种培养；将离心收集到的细胞用所述完全培养液重悬接种于培养瓶中培养；培养得到的细胞为P1代细胞；步骤九，消化传代培养；待P1细胞长至80%—95%融合后以，用胰蛋白酶进行消化收集并传代培养，消化传代培养得到的细胞为P2代细胞；其传代培养的方式是以一瓶传5瓶的比例进行传代；步骤十，细胞鉴定；待P2代细胞长至80%—95%融合后，消化收集细胞进行鉴定。