[发明专利]一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及应用

摘要

本发明公开了一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法及应用。基于融合PCR技术以及T载体克隆技术，首次构建并鉴定PhoP/PhoR基因的置换型缺失突变载体T‑PhoPR，利用电转化技术使得重组的PhoP/PhoR基因缺失突变载体进入结核分枝杆菌感受态细胞，通过染色体同源重组以及多重筛选、鉴定，首次获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株。本发明构建的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株，同时敲除了参与调控MTB感受宿主微环境变化的PhoP基因和PhoR基因，可降低MTB的耐药性，使其对抗结核药物恢复敏感性，为探索MTB PhoP/PhoR双组分系统对结核分枝杆菌耐药性的调控机制提供一定的帮助，为进一步寻找新的抗结核药物作用靶点奠定基础提供依据。

主权项

1.一种结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、结核分枝杆菌 PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体的构建及鉴定方法通过SOE‑PCR技术、琼脂糖凝胶回收试剂盒及琼脂糖凝胶电泳法纯化、构建并鉴定结核分枝杆菌缺失突变片段PhoPR‑K，通过T载体克隆技术及基因测序技术将构建鉴定成功的结核分杆菌PhoP/PhoR基因置换型缺失突变载体命名为T‑PhoPR，并利用质粒提取试剂盒提取并纯化质粒，用DNA凝胶电泳鉴定，同时用紫外分光光度计测定质粒的浓度及纯度；步骤2、结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株的构建及筛选方法通过电转化技术使得10μl T‑PhoPR进入100μl新鲜制备的MTB感受态细胞，同时取110μl不加任何质粒的结核分枝杆菌感受态细胞作为空白对照，利用染色体同源重组以及多重筛选、鉴定获得含有卡那霉素抗性基因的结核杆菌PhoPR基因缺失突变菌株。