[发明专利]一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合

摘要

本发明属于动物病毒防制技术领域。具体涉及一种特异性检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法及其引物组合，与靶DNA片段的检测领域相关。筛选了一组高灵敏、特异性的LAMP引物，使用NCBI BLAST在线软件分析针对非洲猪瘟病毒基因组序列的特异性基因B646L，利用LAMP primerexplorer网页对该病毒特异性片段设计多组特异性引物，得到灵敏性最高，特异性最强的LAMP引物。利用LAMP快速扩增模版DNA特异性区域，通过加入荧光染料，可在荧光定量PCR仪上完成反应及结果判定，整个反应不超过50min。本发明筛选引物组合具有灵敏度高、特异性强特点。本发明LAMP方法操作简单，成本低，结果易于判断。

主权项

1.一种高灵敏、特异性地检测非洲猪瘟病毒的LAMP方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用NCBI中BLAST软件对GeneBank中ASFV的全基因组进行分析，找出GenBank登录号MH722357.1的特异性保守基因B646L，并确定基因序列的准确性；(2)根据步骤(1)确定的序列，针对特异性保守区基因B646L，利用LAMP primerexplorer设计如下所述的特异性引物，这些引物分别针对特异性保守区的6个区域，每组引物包括一对F3/B3内引物，一对FIP/BIP外引物和一对LF/LB环引物；对多组特异性引物进行筛选，最后确定出特异性最强、灵敏度最高的引物进行扩增；所述的LAMP引物的序列如下所述：外引物：F3:ATCCAGAGCAAGAGAAT；B3:ATACCACAAGATCAGCCG；内引物：FIP:CAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAATACCCTTCCACTACGGAG；BIP:ACCAACCCAGTGGTCATATTAACTAGACCCCACGTAATCCG；环引物：LF:GGGGGTTTTAATCGCATT；LB:ATCCAGAGCAAGAGAAT；(3)优化后的LAMP体系为：20μmol/L的F3，B3引物各1μL；40μmol/L的FIP，BIP引物各1μL；10μmol/L的LF，LB引物各1μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP3.5μL；100mmol/L的Mg²⁺0.5μL；8U的Bst DNA聚合酶1.25μL；模板DNA 1μL；Eva Green20x 2μL，加灭菌双蒸水至25ul LAMP扩增反应体系；(4)构建含目的片段的质粒，浓度稀释至10⁸拷贝/μL，取1μL加入反应液中并混匀；(5)置BIO‑RAD96孔荧光定量PCR仪中进行LAMP扩增，收集荧光信号，反应程序为：63℃，20s，120个循环，SYBR通道收集荧光；(6)扩增反应结束后，根据荧光PCR仪的扩增曲线和CT值判断检测结果；待测样品发生扩增，判断检测样本为阳性；待测样品不发生扩增，判断检测样本为阴性。