[发明专利]一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，要解决的是现有治疗RHD的疫苗中存在的问题。本发明具体步骤如下：步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体；步骤二，制备CEF单层细胞；步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组；步骤四，鸡痘病毒的筛选。本发明应用基因重组技术，构建含有IL‑18的重组鸡痘疫苗，再经过加压筛选、鉴定、培养、浓缩后的毒力测定，免疫原性的检测，具有易培养、易储存、无毒性扩散、易生产、提高免疫效果、节省资金等优点，应用前景广阔。

主权项

1.一种重组鸡痘病毒疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤一，筛选重组鸡痘病毒中间转移载体：将RHDV结构蛋白VP60插入复合启动子的下游，将IL‑18基因插入串联启动子的下游，构建了含有RHDV结构蛋白VP60和IL‑18的鸡痘病毒中间转移载体；步骤二，制备CEF单层细胞：取9‑11日龄无特定病原体鸡胚，分别用碘酒、酒精棉对鸡胚进行擦拭消毒后放在超净台内，将有气室的部位朝上，小心地用无菌镊子敲破蛋壳，沿气室边缘夹掉蛋壳，再用心的无菌镊子接开尿囊绒毛膜，再用弯头镊子深入蛋壳内取出鸡胚后放入平皿中，去头、四肢、内脏，剪碎成小块，再用PBS清洗3遍，至组织款发白为止，将剪碎的组织小块移入另一小平皿内，加入适量的胰酶和磷酸盐缓冲液，于37℃细胞培养箱中消化10分钟左右，倒掉液体后加入生长液，用枪头反复吹成单个细胞，再用灭菌纱布过滤，将过滤的得到的细胞悬液稀释10倍，使细胞终止浓度到达50万个/ml，每个细胞瓶中加入8ml，放入二氧化碳培养箱中，将培养至CEF细胞长成融合单层，待用；步骤三，鸡痘病毒细胞内同源重组：取新制备的生长状态良好的CEF细胞，倒掉其中的培养液，清洗并且加入胰酶，静置至壁上细胞全部消化下来，倾去并洗去残留胰酶，选择融合度为70～80％的融合单层CEF细胞，吸去培养上清液，然后按0.1moL接种FPV 282E4株，吸附，在鸡痘病毒吸附培养的同时，向85μL的MEM完全培养液中加入15μL DOTAP Liposomal，轻轻混匀，得到前混合物，另取50mL MEM完全培养液加入10～20μg鸡痘病毒中间转移载体并且混匀，得到后混合物，然后将后混合物滴加于前混合物中轻轻吹打混匀，待鸡痘病毒吸附1.5～3h后，将质粒与转染试剂的混合液加到上述单层细胞上，并用无血清MEM完全培养液将每孔中的液体补足至1mL，培养12～18h，然后每孔补加MEM完全培养液，继续培养72～120h收病毒，‑70℃保存；步骤四，鸡痘病毒的筛选：向MEM完全培养液中加入BrdU，10～14小时后吸去MEM完全培养液，接种步骤三得到的病毒，再用含BrdU的培养液将每孔中的液体补足至3ml，接种病毒后120h收获细胞，将收获细胞接种于BrdU预处理后的CEF单层细胞上，继续培养120h，收获细胞，经过三次BrdU加压筛选后，将收获的细胞再接种于CEF单层细胞上，在无BrdU的条件下培养，挑选单个病毒蚀斑，并进行三次蚀斑纯化、扩增，再筛选重组病毒。