[发明专利]一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法

摘要

本发明属于动物传染病防制技术领域。具体涉及一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法。利用CRISPR/Cas9系统对含有PEDV AJ1102株全长cDNA的BAC质粒进行切割，再通过同源重组方式获得EGFP基因替换PEDV AJ1102株ORF3基因的重组BAC质粒，转染细胞后拯救出重组病毒rAJ1102‑△ORF3‑EGFP。由于不同的猪肠道冠状病毒具有相似的基因组结构与复制策略，本发明也适合于其它猪肠道冠状病毒重组病毒的构建。与传统方法相比，本发明具有靶点选择宽泛，特异性强，操作简单，效率高和实验周期短等突出优点，在一周之内便可获得重组病毒，是一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法。

主权项

1.一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计靶向猪流行性腹泻病毒(PEDV)AJ1102株ORF3基因的两个sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统体外切割含有PEDV AJ1102株全长cDNA的BAC质粒pBAC‑AJ1102；(2)利用融合PCR扩增含有猪流行性腹泻病毒AJ1102株ORF3基因上游序列、EGFP基因和PEDV AJ1102株ORF3基因下游序列的片段，该片段与切割后的pBAC‑AJ1102上、下游各含有20bp的同源臂；(3)用融合克隆重组酶将切割后的质粒pBAC‑AJ1102与融合PCR产物以摩尔比为1:5的比例进行同源重组；(4)将重组产物转化至DH10B化学感受态细胞中，利用PCR筛选阳性克隆，并对PCR产物进行测序；(5)将测序正确的阳性克隆扩大培养后大量提取质粒；(6)将提取的质粒用Lipofectamine 3000转染至Vero细胞，转染6h后，换上含有10μg/mL胰酶的无血清DMEM培养基，逐日观察细胞病变，其中步骤(2)中所述的ORF3基因上游序列，EGFP基因和ORF3基因下游序列的核苷酸序列分别如下所示：ORF3基因上游序列：AGAGGCTATTAGTCAAACTTCTAAGGGTTTGAACACTGTGGCTCATGCGCTTACCAAGGTCCAAGAGGTTGTTAATTCGCAGGGTGCAGCTTTGACCCAACTTACCGTACAGCTGCAACACAACTTCCAAGCCATTTCTAGTTCTATTGATGACATTTACTCCCGACTTGACATTCTTTCAGCCGATGTTCAGGTAGACCGTCTCATCACCGGCAGATTATCAGCACTTAATGCTTTTGTTGCTCAAACCCTTACTAAGTATACTGAGGTTCAGGCTAGCAGGAAACTAGCACAGCAAAAGGTTAATGAGTGCGTTAAATCGCAATCTCAGCGTTATGGTTTTTGTGGTGGTGATGGCGAGCACATTTTCTCTCTGGTACAGGCCGCACCTCAAGGCCTGCTGTTTTTACACACAGTACTTGTACCGGGTGACTTTGTAAATGTTATTGCCATCGCTGGCTTATGTGTTAACGATGAAATTGCCTTGACTCTACGTGAGCCTGGTTTAGTCTTGTTTACGCATGAACTTCAAGATACTGCGACGGAATATTTTGTTTCATCGCGACGTATGTATGAACCTAGAAAACCTACCGTTGGTGATTTTGTTCAAATTGAGAGTTGTGTGGTCACCTATGGCAATTTGACTAGAGACCAACTACCAGAAGTAATCCCAGATTACATCGATGTTAACCAAACACTTGATGAGATTTTAGCTTCTCTGCCCAATAGAACTGGTCCAAGTCTTTCTCTAGATGTTTTTAATGCCACTTATCTTAATCTTACTGGTGAAATTGCAGATTTAGAGCAGCGTTCAGAGTCTCTCCGTAATACTACAGAAGAGCTTCAAAGTCTTATATATAATATCAACAACACACTAGTTGACCTTGAGTGGCTCAACCGAGTTGAGACATATATCAAGTGGCCGTGGTGGGTTTGGTTGATTATTTTTATTGTTCTCATCTTTGTTGTGTCATTACTAGTGTTCTGCTGCATTTCCACGGGTTGTTGTGGATGCTGCGGCTGCTGTGGTGCTTGTTTTTCAGGTTGTTGTAGGGGTCCTAGACTTCAACCTTACGAAGCTTTTGAAAAGGTCCACGTGCAGTG；EGFP基因：GAAAAGGTCCACGTGCAGTGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA；ORF3基因下游序列：TGGACGAGCTGTACAAGTAAGATTCAATTCAACTAGACGAGTATGCTACAATTAGTGAATGATAATGGTCTAGTAGTTAATGTTATACTTTGGCTTTTCGTACTCTTTTTCCTGCTTATTATAAGCATTACTTTCGTCCAATTGGTTAATCTGTGCTTCACTTGTCACCGGTTGTGTAATAGCGCAGTTTACACACCTATAGGGCGTTTGTATAGAGTTTATAAGTTTTACATGCAAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTGAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGCTGGCACTTTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAACTGGGTCTTTTTTGCTTT。