[发明专利]基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法

摘要

本发明公开了一种基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法，包括以下步骤：组织收集、蛋白样本制备、建立谱图数据库、蛋白质定性定量分析和差异表达蛋白质筛选。本发明选取3月龄和1岁龄藏绵羊睾丸组织，运用常规DDA质谱检测技术分析并建立图谱数据库，随后采用DIA方法进行质谱数据采集，并对样品中的蛋白质进行定性定量分析，从而获得藏绵羊睾丸中的差异表达蛋白质。利用该方法可实现对藏绵羊睾丸差异表达蛋白的定量筛选，这对于后续从蛋白质组学角度研究在高海拔条件下藏绵羊睾丸发育或精子发生的分子机制提供了十分重要的理论基础。

主权项

1.一种基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A、组织收集羊屠宰后，取出睾丸组织，用PBS清洗外部血渍并剥除白膜后，将其剪成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小组织快，迅速冻存于液氮中用于蛋白样本的制备；步骤B、蛋白样本制备向睾丸组织中加入裂解液，超声裂解；4℃，14000rpm条件下离心25‑35min后，吸取上清液，用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度；取50μg蛋白质稀释至50μL，随后加入1M DTT 1μL，在55℃孵育50‑75min；加入1M碘乙酰胺(IAA)5μL，室温避光50‑75min；加入300μL预冷的丙酮沉淀105‑140min，沉淀用胰蛋白酶酶解过夜；步骤C、建立谱图数据库将所有酶解后的肽段混合物溶解于缓冲液甲(20mM甲酸铵水溶液，pH＝10.0)中，用Ultimate 3000系统连接反向柱进行高pH反向分离，分离使用线性梯度，40min内5％溶液乙至45％溶液乙；柱子在初始条件下平衡15min，柱流速维持在1mL/min，柱温维持在30℃；收集到6个部分，各个部分在真空浓缩仪中干燥；将除盐冻干后的肽段重溶于溶液丙中，后经由配备在线纳喷离子源的LC‑MS/MS分析；整套系统为串联EASY‑nLC 1200系统的轨道阱质谱仪；总共上样3μL，以120min梯度分离：5％溶液丁至35％溶液丁；柱流量控制在200nL/min，电喷雾电压2kV；轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换；质谱参数设置如下：(1)MS：扫描范围(m/z)：350–1500；分辨率：120,000；AGC target：4e5；最大注入时间：50ms；动态排除时间：30s；(2)HCD‑MS/MS：分辨率：15,000；AGC target＝5e4；最大注入时间：35ms；碰撞能量：32；原始数据通过Spectronaut X(Biognosys AG)合并分析搜库，数据库使用Uniprot或提供的数据库，另外同时搜索污染序列库，以判断样本是否存在污染，设置胰蛋白酶酶解；搜库参数：固定修饰：脲甲基化，可变修饰：蛋氨酸氧化；母离子和肽段水平的假阳性率(FDR)都设置为1％；各样品加入30μL溶液丙制成悬浮液，取出9μL加入1μL 10×iRT肽段，混合后用纳米液相色谱分离，经在线电喷雾串联质谱分析；整套实验系统为串联EASY‑nLC 1200系统的轨道阱质谱仪；总共上样3μL，以120min梯度分离：5％溶液丁至35％溶液丁；柱流量控制在200nL/min，电喷雾电压2kV；质谱参数设置如下：(1)MS:扫描范围(m/z)：350–1500；分辨率：120,000；AGC target：4e6；最大注入时间：50ms；(2)HCD‑MS/MS：分辨率：30,000；AGC target：1e6；碰撞能量：32；能量增加：5％；(3)可变窗口采集，设置了60个窗口，设置重叠串口，每个窗口重叠1m/z；步骤D、蛋白质定性定量分析采用QuiC(Biognosys)软件对原始质谱数据进行质控后，运用Pulsar软件对DDA采集模式得到的数据进行建库，建库鉴定标准为：前体阈值1.0％FDR，蛋白质阈值1.0％FDR，用于后续DIA数据的定性分析；步骤E、差异表达蛋白质筛选以相对定量值差异倍数的绝对值＞2.0倍，并且Student′s t‑test qvalue(检测Q值)<0.05筛选差异表达蛋白质。