[发明专利]一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法在审
| 申请号： | 201910825712.X | 申请日： | 2019-09-03 |
| 公开（公告）号： | CN110724690A | 公开（公告）日： | 2020-01-24 |
| 发明（设计）人： | 李彦敏;普拉贾帕蒂·米拉;窦永喜;朱学亮;张志东;赵帅阳;秦晓东 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C12N15/70;C07K14/705;C07K1/22 |
| 代理公司： | 11740 北京棘龙知识产权代理有限公司 | 代理人： | 戴丽伟 |
| 地址： | 730030 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，具体涉及小反刍兽疫病毒(PPRV)检测技术领域，具体方法如下：S1、获得山羊SLAM基因和氨基酸序列，设计特异性引物，通过RT‑PCR方法获得SLAM基因片段；S2、将扩增的SLAM基因片段克隆到PET SUMO载体中，构建阳性重组质粒PET SUMO‑SLAM；S3、将阳性重组质粒PET SUMO‑SLAM转化到感受态Rosetta细胞中；S4、将转化的细胞在LB培养基平板中培养；S5、将含有构建的质粒的新转化的大肠杆菌的单菌落在LB液体培养基中培养；S6、IPTG诱导融合蛋白的表达，然后通过SDS PAGE分析。本发明为PPRV抗原检测提供一种捕获蛋白，用于开发PPRV抗原检测试剂盒，从而用于检测PPRV病毒，使得检测方法具有更好的特异性和灵敏性。 | ||
| 搜索关键词： | 阳性重组质粒 构建 山羊 转化 抗原检测试剂盒 基因片段克隆 检测技术领域 大肠杆菌 病毒 氨基酸序列 特异性引物 细胞 基因片段 抗原检测 融合蛋白 原核表达 基因 单菌落 感受态 灵敏性 检测 扩增 质粒 捕获 蛋白 克隆 分析 开发 | ||
【主权项】：
1.一种山羊SLAM基因的克隆与原核表达方法，其特征在于：具体方法如下：/nS1、通过GenBank获得山羊SLAM基因和氨基酸序列，根据编码细胞外结构域的SLAM基因片段设计特异性引物，并通过RT-PCR方法获得SLAM基因片段；/nS2、SDS-PAGE电泳检测PCR产物，将扩增的山羊SLAM基因片段克隆到PET SUMO载体中，并通过DNA测定序列，构建阳性重组质粒PET SUMO-SLAM；/nS3、将阳性重组质粒PET SUMO-SLAM转化到感受态Rosetta细胞中；/nS4、将转化的细胞在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板中于37℃培养；/nS5、将含有构建的质粒的新转化的大肠杆菌的单菌落在含有50μg/mL卡那霉素的3mlLB液体培养基中培养，并在37℃温育直至600nm处的OD值达到0.6；/nS6、IPTG诱导融合蛋白的表达，然后通过Ni亲和层析纯化得到SLAM重组蛋白，纯化后，用滴定法对包合蛋白进行复性，然后通过SDS PAGE分析。/n
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