[发明专利]一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法在审
| 申请号： | 201910826389.8 | 申请日： | 2019-09-03 |
| 公开（公告）号： | CN110511962A | 公开（公告）日： | 2019-11-29 |
| 发明（设计）人： | 王勇;谢飞;周晓杨;王露露;林婷婷;郭科男;魏泓 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军陆军军医大学 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22;C12N15/113;A01K67/027 |
| 代理公司： | 51232 成都点睛专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 李玉兴<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 400038 重*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | 本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法。本发明要解决的技术问题是提供一种Gjb2基因编码序列编辑精准编辑的猪模型制备方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法。该方法包括以下步骤：a、准备sgRNA对；b、将sgRNA对、供体DNA、编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白的混合物导入猪早期胚胎细胞质中；c、将猪早期胚胎移至受体母猪输卵管中，使之受孕；d、妊娠期满后产下仔猪，得到Gjb2基因精准编辑后的猪模型。本发明方法可高效精准的实现猪Gjb2基因编码序列的精准突变，该类突变动物模型具有很好的应用前景。 | ||
| 搜索关键词： | 编码序列 早期胚胎 双位 切割 细胞质 纯化重组蛋白 动物基因组 母猪输卵管 模型制备 突变动物 供体DNA 混合物 仔猪 妊娠 突变 期满 应用 | ||
【主权项】：
1.通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于包括以下步骤：/na、准备一对sgRNA，其中一条sgRNA识别Gjb2基因编码序列上游的切割位点，另一条sgRNA识别基因编码序列下游的切割位点；/n所述识别Gjb2基因编码序列下游切割位点的sgRNA能识别猪的Gjb2基因上的PAM位点为CGG；/n所述识别Gjb2基因编码序列上游切割位点的sgRNA能识别猪的Gjb2基因上的PAM位点为GGG。/nb、将步骤a所述的一对sgRNA、带有预期突变序列的供体DNA、编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白充分混合后，将混合物通过显微注射导入猪早期胚胎的细胞质中；/nc、将步骤b处理后的猪早期胚胎移植至受体母猪的输卵管中，使受体母猪受孕；/nd、受孕的受体母猪在妊娠期满后产下仔猪，得到Gjb2基因精准编辑后的猪模型。/n
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