[发明专利]一种基于S1酶切割的适配体截短优化方法

摘要

一种基于S1核酸酶切割的适配体截短优化方法属于医疗诊断领域。该方法包括磁珠和蛋白偶联(MP)、适配体和MP孵育(MPA)、S1核酸酶截短优化、质谱分析。适配体通过此方法实现序列长度的截短优化。基于空间位阻，核酸酶切割适配体与靶物结合紧密区段序列效率较低，该区段被大量保存并在质谱检测中呈现出较大的离子丰度。截短后序列与靶物PD‑L1蛋白的KD值比原序列下降54.67％，验证了该方法的可行性。本发明可为适配体的截短优化提供基于实验的方法，并可用于确定适配体与靶物的结合区域。

主权项

1.一种基于S1酶切割的适配体截短优化方法，其特征在于，/n以PD-L1为靶分子，以S1核酸酶为截短酶，通过以下技术方案实现：/n1)合成以下序列所示的PD-L1核酸适配体：/n5’-GCT GTG TGA CTC CTG CAA GAC GGA CCA GCC TTG CCG CAA GAC GGA CCA GGGATT CAA ACG AGC AGC TGT ATC TTG TCT CC-3’。/n2)利用核酸酶切截短优化适配体，具体如下：/n酶切截短优化过程所用试剂：2×蛋白结合液浓度组成为：100mM磷酸钠，600mM NaCl，0.02％吐温-20，pH8.0；1×蛋白结合液即把2×蛋白结合液稀释1倍；/nSELEX结合液：150mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl₂，1mM CaCl₂，40mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.4；/n洗脱液：20mM三羟甲基氨基甲烷，500mM咪唑，pH 7.5；/n5×反应液：200mM乙酸钠，1.5M NaCl，10mM ZnSO4，pH 4.5；/n2.1 PD-L1蛋白重建/n2.2 PD-L1蛋白和磁珠连接/n2.2.1 取5μL PD-L1蛋白溶液加入到700μL 1×蛋白结合液中；/n2.2.2 在小瓶中混匀磁珠/n2.2.3 将50μL磁珠转移到微离心管上，并放置在磁分离架上2分钟，抽吸并清除上清液；向磁珠中加入样品，混匀；/n2.2.4 在37℃下在滚筒上孵育5分钟，孵育结束置于磁分离架2分钟，弃上清液；/n2.2.5 取1×蛋白结合液洗涤磁珠-蛋白复合体3次，磁分离2分钟弃上清液；/n2.3 适配体孵育/n2.3.1 适配体溶于无菌水，95℃热变性5分钟，冰浴10分钟，与等体积SELEX结合液混匀；/n2.3.2 加入到磁珠-蛋白质复合物中，混匀，室温下孵育30分钟；/n2.3.3 孵育结束磁分离去上清液，用PBS-T缓冲液清洗2次；/n2.4S1 核酸酶切实验/n2.4.1 取2.3.3得到的磁珠复合物及S1核酸酶加入到1×反应液体系中，37℃反应30分钟，磁分离，用PBS-T洗涤2次，去上清液；/n2.4.2 加入200μL洗脱液，混合均匀，100℃沸水浴10分钟，磁分离，取上清液。/n