[发明专利]一种待测样品中具有poly(A)尾巴的RNA的测序文库的构建方法有效
| 申请号： | 201910837492.2 | 申请日： | 2019-09-05 |
| 公开（公告）号： | CN110499356B | 公开（公告）日： | 2021-06-08 |
| 发明（设计）人： | 陆发隆;刘玉胜 | 申请（专利权）人： | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 闫书宁 |
| 地址： | 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种待测样品中具有poly(A)尾巴的RNA的测序文库的构建方法。该方法包括如下步骤：取待测样品的总RNA，使用引导引物进行末端延伸，然后用USER酶充分消化，回收长度为200nt以上的核酸片段；将核酸片段进行反转录，然后用TSO进行模板交换，得到cDNA；取所述cDNA，采用PCR引物进行PCR扩增，获得扩增cDNA；取所述扩增cDNA，构建测序文库，最后上机测序。实验证明，采用本发明提供的方法构建的测序文库可以分析具有poly(A)尾巴的RNA的序列，包括poly(A)尾巴的序列。本发明对于RNA的poly(A)尾巴的研究具有重要的应用价值。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 样品 具有 poly 尾巴 rna 序文 构建 方法 | ||
【主权项】：
1.待测样品中具有poly(A)尾巴的RNA的测序文库的构建方法，依次包括如下步骤：/n(a1)取待测样品的总RNA，使用引导引物进行末端延伸，然后加入USER酶充分消化，回收长度为200nt以上的核酸片段；/n引导引物从5’末端至3’末端依次包括DNA片段甲和DNA片段丙；/nDNA片段甲为15-40bp的任意序列且不能与poly(A)尾巴结合，用于PCR扩增；/nDNA片段丙由3-24bp核苷酸组成，每个核苷酸为dU或T；DNA片段丙5’末端的3个核苷酸中至少一个为dU；/n(a2)取所述核酸片段，用RT引物进行反转录，得到cDNA；/nRT引物是DNA片段甲的核苷酸序列的全部或者部分；/n(a3)取所述cDNA，用TSO进行模板交换；/nTSO从5’末端至3’末端依次包括DNA片段丁和核酸片段丁；/nDNA片段丁为15-40bp的任意序列，用于PCR扩增；/n核酸片段丁包括区段2，区段2用于和所述cDNA结合；区段2由N个鸟嘌呤核糖核苷酸或“(N-1)个鸟嘌呤核糖核苷酸和1个进行了锁核酸修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸”组成，N为3以上的自然数；/n(a4)取完成步骤(a3)的cDNA，采用PCR引物进行PCR扩增，获得扩增cDNA；/nPCR引物中的上游引物是DNA片段丁的核苷酸序列的全部或者部分；/nPCR引物中的下游引物是DNA片段甲的核苷酸序列的全部或者部分；/n(a5)取所述扩增cDNA，测序；获得待测样品中具有poly(A)尾巴的RNA的测序文库。/n
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