[发明专利]一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201910868305.7 | 申请日： | 2019-09-16 |
| 公开（公告）号： | CN110551796A | 公开（公告）日： | 2019-12-10 |
| 发明（设计）人： | 周勇;唐银 | 申请（专利权）人： | 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6841 | 分类号： | C12Q1/6841;C12Q1/6806;C12N15/11 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 400039 重庆市九龙坡区二*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种用于FISH的快速标记基因组探针及其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：制备带有荧光染料标记的dcas9蛋白，再针对目标基因区域设计并合成sgRNA库，最后将带荧光染料标记的dcas9蛋白与sgRNA库混合得到sgRNA‑dcas9酶探针库。本发明制备所得sgRNA‑dcas9酶探针采用dCas9介导的FISH技术利用CRISPR系统进行DNA快速杂交，具有检测时间短（可在1小时内完成检测），准确性高，特异性好、假阳性低、操作条件温和（室温和37°C，可更好地维持细胞形态和DNA结构）、操作简便灵活、成本低等优点。 | ||
| 搜索关键词： | 制备 荧光染料标记 探针 蛋白 制备方法和应用 目标基因区域 基因组探针 技术利用 快速标记 快速杂交 细胞形态 假阳性 检测 介导 合成 灵活 | ||
【主权项】：
1.一种用于FISH的快速标记基因组探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）制备dcas9蛋白：原核表达及纯化得到dcas9蛋白，将荧光染料标记dcas9蛋白；/n（2）制备sgRNA库：从NCBI下载目标基因序列，针对目标基因区域保守序列，利用在线网站http : //crispr.mit.edu /分析可能的 sgRNA位点，其中PAM 序列为NGG，在每条sgRNA核心序列的5’端加上19bp的序列如SEQ ID NO.36所示，3’端加上86bp的序列如SEQ IDNO.37所示，得到一系列优化sgRNA序列，化学合成所述优化sgRNA序列，将合成的sgRNA序列连入pUC57-simple质粒，通过质粒PCR扩增、PCR产物体外转录、转录产物纯化，得到一系列sgRNA，即sgRNA库，PCR扩增引物如SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39所示；/n（3）构建sgRNA-dcas9酶探针库：将步骤（1）中所得的荧光染料标记的dcas9蛋白分别与步骤（2）中所得的sgRNA库混合组装，所述dcas9蛋白与所述sgRNA库按照摩尔比例为1:1-1:4进行混合组装，即得到sgRNA-dcas9酶探针库。/n
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