[发明专利]一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用

摘要

本发明公开了一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统，所述CRISPR/Cas9系统包括以下步骤：(1)靶位点1设计在黄颡鱼dmrt1基因第一外显子上，靶位点2设计在第三外显子上；(2)根据步骤(1)的靶位点序列设计引物检测亲鱼中靶位点的准确性，用dmrt1 E1 F和dmrt1 E1 R扩增靶位点1及附近序列，用dmrt1 E3 F和dmrt1 E3 R扩增靶位点2及附近序列；(3)以pUC19‑gRNA‑scaffold质粒为模板，用dmrt1 E1 gRNA F和gRNA R进行gRNA1片段的PCR扩增，用dmrt1 E3 gRNA F和gRNA R进行gRNA2片段的PCR扩增；以上述PCR产物为模板，体外转录并纯化获得gRNA；(4)以pXT7‑hCas9线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9 mRNA；(5)将Cas9 mRNA和两个gRNA显微注射到黄颡鱼一细胞期胚胎中；(6)检测突变类型，计算基因编辑率。