[发明专利]一种对抗体pH依赖结合活性的快速改造及筛选方法

摘要

本发明公开一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法，包括步骤：(1)构建野生型抗体scFv质粒模板；(2)对抗体的6个CDR区进行定点突变，用组氨酸替代CDR区域的每个氨基酸；(3)建立Capture‑ELISA条件并进行高通量筛选；(4)KD‑ELISA和FACS检测：对样品进行梯度稀释后，用不同pH buffer进行KD‑ELISA的检测，根据检测数据绘制的曲线，确认目标克隆在抗原表面和细胞表面靶点的pH依赖结合活性。本发明提供的方法能够高通量、高效率、低成本的获得pH依赖结合活性的抗体。

主权项

1.一种对抗体pH依赖结合活性的改造及筛选的方法，其特征在于，包括步骤：/n(1)构建野生型抗体scFv质粒模板：将抗体的重链和轻链可变区通过连接肽连接后，利用限制性内切酶位点接入大肠杆菌表达载体，获得完整的scFv质粒模板，方便对可变区序列的改造；/n(2)对抗体的6个CDR区进行定点突变，通过PCR的方法，用组氨酸替代CDR区域的每个氨基酸，然后用限制性内切酶消化质粒模板，获得突变后的PCR产物转化大肠杆菌，用诱导剂诱导后获得可溶性scFv抗体；/n(3)建立Capture-ELISA条件并进行高通量筛选：/n首先，包被不同浓度的anti-c-Myc抗体，c-Myc标签存在于scFv抗体上，加入诱导后的突变体表达上清，用不同的缓冲溶液调整pH，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，孵育，使可溶性scFv抗体片段定量地捕获在ELISA板上；/n然后加入不同浓度的带有标签的抗原，用不同pH的缓冲溶液稀释，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，再孵育；/n然后加入检测抗原标签的二抗，用不同pH的缓冲溶液稀释，同时在相应不同的pH条件下进行筛选，测得抗原-抗体结合的亲和力信号；/n筛选的要求为：保证大肠杆菌表达的未经纯化的抗体在实验中保持pH稳定且不受细菌培养液和分泌物影响；筛选出的条件包括：包被抗体浓度，缓冲液pH和盐浓度，抗原浓度；/n(4)KD-ELISA和FACS检测：对样品进行梯度稀释后，用不同pH buffer进行KD-ELISA和FACS的检测，根据检测数据绘制的曲线，确认目标克隆在抗原表面和细胞表面靶点的pH依赖结合活性。/n