[发明专利]一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用有效
| 申请号： | 201910885790.9 | 申请日： | 2019-09-19 |
| 公开（公告）号： | CN110527673A | 公开（公告）日： | 2019-12-03 |
| 发明（设计）人： | 谢渊;杨广宇;罗漫杰;王梁 | 申请（专利权）人： | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/04 | 分类号： | C12N9/04;C12N15/70 |
| 代理公司： | 31253 上海精晟知识产权代理有限公司 | 代理人： | 周琼<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，具体包括以下步骤：S1、葡萄糖脱氢酶基因的构建，S2、葡萄糖脱氢酶基因的插入，S3、菌的培养，S4、菌体破碎过滤处理，S5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备，S6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化，本发明涉及生物工程技术领域。该葡萄糖脱氢酶的制备方法及其应用，可实现通过对葡萄糖脱氢酶纯化的方法进行改进，来提高葡萄糖脱氢酶的纯度，很好的达到了通过采用层析和分离透析两种提纯方法共同协作，来使葡萄糖脱氢酶的纯度得到很好提高的目的，大大提升了提纯效果，很好的降低了提纯得到的葡萄糖脱氢蛋白酶中杂质蛋白的含量，十分有利于葡萄糖脱氢酶在其他领域的应用。 | ||
| 搜索关键词： | 葡萄糖脱氢酶 制备 葡萄糖脱氢酶基因 提纯 生物工程技术领域 应用 葡萄糖脱氢 蛋白酶 粗纯化物 过滤处理 菌体破碎 提纯效果 杂质蛋白 层析 构建 两级 透析 协作 改进 | ||
【主权项】：
1.一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：/nS1、葡萄糖脱氢酶基因的构建：选取来自乙酸钙不动杆菌的葡萄糖脱氢酶基因为模板，提取土曲霉基因组，设计引物，进行PCR反应，克隆葡萄糖脱氢酶基因；/nS2、葡萄糖脱氢酶基因的插入：将步骤S1扩增后的葡萄糖脱氢酶基因插入到表达载体的多克隆位点上，将构建成的质粒转化到大肠杆菌中；/nS3、菌的培养：然后将该步骤S2中得到的转化体用培养瓶，培养在400-450mL培养基中，在温度为36-37℃下通过震荡设备培养8-12h，然后接种在5-7L的培养基中，培养开始后2-3小时后，添加异丙基硫代半乳糖苷，使其最终浓度达到0.3mmol/L，然后再培养10-15小时，通过离心设备分离菌体并收集菌体；/nS4、菌体破碎过滤处理：之后用0.5-0.85％的NaCl溶液洗2-3次，将该菌体悬浮在碳酸氢钠缓冲液中，然后用破碎设备破碎后，离心分离2-3次，未破碎的菌体和沉淀物通过离心过滤设备除去；/nS5、葡萄糖脱氢酶的粗纯化物的制备：之后将步骤S4分离后的上清液进行超离心分离，得到作为水溶液级分的上清液，然后将该级分在缓冲液中2-4℃透析8-12h，从而得到葡萄糖脱氢酶的粗纯化物；/nS6、葡萄糖脱氢酶的两级纯化：将步骤S5制备的粗纯化物在加入柱前，先在0.1-0.2μm过滤器上过滤，然后使用CM-5PW柱，使用缓冲液及NaCl进行阳离子交换层析，然后将层析洗脱出的葡萄糖脱氢酶蛋白质进行集中收集，之后对收集的蛋白质转移至透析离心设备中，通过密度梯度离心对葡萄糖脱氢蛋白酶进行充分纯化沉淀分离，最后对再次纯化的葡萄糖脱氢蛋白酶进行收集即可。/n
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