[发明专利]紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法在审
| 申请号： | 201911001520.3 | 申请日： | 2019-10-21 |
| 公开（公告）号： | CN110628788A | 公开（公告）日： | 2019-12-31 |
| 发明（设计）人： | 张婵;王成涛;孙宝国;李颖慧 | 申请（专利权）人： | 北京工商大学 |
| 主分类号： | C12N15/31 | 分类号： | C12N15/31;C12N15/80;C12N1/15;C12R1/645 |
| 代理公司： | 11692 北京开林佰兴专利代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 刘帅帅 |
| 地址： | 100048*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明公开了紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法，包括菌种培养、过表达载体构建、过表达质粒转化等步骤。本发明成功克隆出紫色红曲菌M1菌株中的 | ||
| 搜索关键词： | 菌株 构建 基因 紫色红曲菌 表达质粒 红曲菌 次级代谢产物 表达工程菌 基因过表达 菌丝体形态 菌体生物量 表达载体 红曲色素 菌种培养 生理指标 下调基因 菌丝体 体干 克隆 验证 成功 转化 发现 | ||
【主权项】：
1.紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：/n(一)菌种培养/n将紫色红曲菌M1菌株在PDA固体培养基上培养，活化2代，每代3-4d，然后接种于液体种子培养基中，以30℃、200r/min培养至种子液培养基呈浅粉色，需48h，将红曲菌种子液以10％的接种量接种于50mL的液体发酵培养基中培养，并以30℃、150r/min培养48h，后将温度改为25℃继续培养至第15d。/n分别收集红曲菌第2d、5d、8d、12d、15d发酵液置于2mL离心管中，12000r/min离心10min，去上清，用灭过菌的超纯水重悬，反复三至四次，最后一步要尽量吸除剩余水分，置于-80℃冰箱中保存。/n(二)红曲菌总RNA的提取/n具体步骤如下：/n1.在2mL离心管中加入475μL的SL和25μL的β-巯基乙醇，取2管于-80℃冰箱保存的红曲菌菌体，在灭过菌的研钵中用液氮速冻，并快速磨成粉末状，取粉末到装有SL溶液的2mL离心管中，立即漩涡震荡混匀，12000rpm离心2min；/n2.吸取500μL上清液至过滤柱CS中，离心，取400μL滤液至空离心管中；/n3.加入160μL的无水乙醇，将混合液移至吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，弃滤液；/n4.在吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，弃滤液；/n5.配制DNaseⅠ工作液：向20μLDNaseⅠ中加入140μLRDD溶液，吸打混匀，向吸附柱CR3中央加入80μL混合液，静置15min；/n6.向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，离心，弃滤液；/n7.向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW，离心，弃滤液；/n8.重复一次步骤7；/n9.空柱离心2min，离心后将吸附柱CR3置于空离心管中，取35μL的RNase-Free ddH
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