[发明专利]一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法有效
| 申请号： | 201911124752.8 | 申请日： | 2019-11-18 |
| 公开（公告）号： | CN110669777B | 公开（公告）日： | 2023-09-12 |
| 发明（设计）人： | 李同祥;孙会刚;田林;汤薇;黄天姿;董玉玮;李文;王春艳;高兆建;王陶 | 申请（专利权）人： | 徐州工程学院 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/80 |
| 代理公司： | 南京瑞弘专利商标事务所(普通合伙) 32249 | 代理人： | 张婷婷 |
| 地址： | 221018 江苏省徐州市泉山区南三环*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，设计引物从pUC57‑AaIT载体中PCR扩增AaIT基因，经酶切、纯化和pbarGPEl构建pbarGPEl‑AaIT载体；用引物扩增出GpdA‑AaIT‑TrpC表达盒；用Not1单酶切pGPS3Ben‑bbchit1并去磷酸化，与用Not1酶切的GpdA‑AaIT‑TrpC连接，转化筛选获得pGPS3Ben‑bbchit1‑AaIT表达载体，将其导入根癌农杆菌感受态细胞中获得阳性转化子菌落；球孢白僵菌孢子悬液和含pGPS3Ben‑bbchit1‑AaIT载体的根癌农杆菌液混合，经固体IM培养基、CPZ选择培养基筛选获得转化球孢白僵菌工程菌株。本发明构建的球孢白僵菌工程菌株可制备高效杀虫生物防治剂，对环境无污染且防治效果良好，适合在生物防治技术领域推广。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 杀虫 球孢白僵菌 工程 构建 方法 | ||
【主权项】：
1.一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法，其特征在于，具体步骤如下：/n第一步、设计扩增AaIT基因引物，引物设计时分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，利用设计的引物从pUC57-AaIT中扩增AaIT基因序列；/n第二步、AaIT基因的PCR扩增产物经纯化后，用BamHI和EcoRI酶进行酶切，同时用BamHI和EcoRI酶酶切pbarGPEl；，分别进行纯化后，建立连接反应体系连接AaIT基因和pbarGPEl；/n第三步、连接产物转化大肠杆菌感受态细胞并进行验证，构建成pbarGPEl-AaIT载体；/n第四步、设计含Not1酶切位点的引物，从pbarGPEl-AaIT载体扩增出GpdA-AaIT-TrpC表达盒；/n第五步、用Not1酶酶切pGPS3Ben-bbchit1，并进行去磷酸化处理；/n第六步、将第五步得到的去磷酸化处理的pGPS3Ben-bbchit1和GpdA-AaIT-TrpC表达盒连接，获得pGPS3Ben-bbchit1-AaIT表达载体，转化大肠杆菌，提取质粒；/n第七步、第六步提取的质粒采用冻融法导入根癌农杆菌感受态细胞中，进行抗性筛选，获取根癌农杆菌阳性菌落；/n第八步、球孢白僵菌孢子悬液和含pGPS3Ben-bbchit1-AaIT载体的根癌农杆菌菌液混合，经在固体IM培养基上共培养和CPZ选择培养基上多次筛选获得转化工程菌株。/n
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