[发明专利]克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法

摘要

本发明涉及微生物领域，特别是克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法。本发明采用基因工程方法，其中包括采用质粒RIJ702为载体对生米卡链霉菌总ＤＮＡ进行鸟枪克隆，转化至变铅青链霉菌ＴＫ５４，挑选转化子和提取重组质粒，得到ＮＯ．９转化子，将自ＮＯ．９转化子提取得到的ＮＯ．９重组质粒转化至螺旋霉素链霉菌，挑选克隆有ＮＯ．９重组质粒的转化子，得到克隆有丙酰化酶基因的包括ＮＯ．６１在内的螺旋霉素链霉菌。将该螺旋霉素链霉菌进行发酵即可工业生产丙酰螺旋霉素，丙酰螺旋霉素在总产物中含量在２０％以上，菌种遗传性稳定。

主权项

1、克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法，其特征在于：a、鸟枪克隆：以质粒PIJ702为载体将经限制性内切酶BglII分别酶切过的米生卡链霉菌(Streptomycesmykarofaciens)总DNA和PIJ702质粒DNA，以3～5∶1浓度比，在T4-DNA连接酶作用下，于10～14℃放置3小时以上进行连接反应，得到重组DNA分子；b、转化：采用a步骤中连接后的重组DNA，以变铅青链霉菌TK54的原生质体为受体，用DNA转化方法将连接后的DNA转化进入所述的受体菌中；c、挑选转化子及提取重组质粒：以含硫链丝菌素终浓度为25微克/毫升的R2琼脂平板挑选含重组质粒的转化子，在所述的含硫链丝菌R2平板上所选的白色菌落即为含重组质粒的转化子，然后采用快速碱变性方法提取含重组质粒转化子，将琼脂糖凝胶电泳后确定为重组质粒的样品再进行限制性内切酶BglII的酶切，酶切后的DNA片段与在同一琼脂糖凝胶电泳平板上泳动的入噬菌体DNA限制性内切酶HindIII酶切片段泳动距离进行比较，从而确定各片段分子量大小，挑选出其中质粒分子量为10.0kb，插入片段为4.16kb的NO.9重组质粒；从而得到NO.9重组质粒DNA；d、NO.9重组质粒的转化：以螺旋霉素链霉菌为受体菌，用DNA转化方法，将该NO.9重组质粒转化进入受体菌内，使丙酰化酶基因在其中克隆和表达；e、挑选克隆有NO.9重组质粒的转化子：在含硫链丝菌素终浓度为25微克/毫升的R2再生琼脂平板上进行挑选转化子，采用DNA转化方法进行原位杂交，以NO.9重组质粒为探针，与固定于硝酸纤维素薄膜上经过变性处理的转化子DNA进行原位杂交，从中挑选出阳性杂交结果的克隆菌株，因此，获得克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌，分类命名为StrepxomycesSpiramycaTicusn.SP.YanetYuNO.61S61，保藏编号为CGMCCNO.0162。