[发明专利]乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法和应用

摘要

本发明涉及乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ酶）抑制剂筛选方法和应用。被筛选物参与试管中的ＡＬＳ酶的酶促反应，如果它是该酶抑制剂，则反应速率下降，产物减少，通过测定反应产物的转化物，快速准确地得出酶的活性和化合物的抑制活性，从而实现ＡＬＳ酶抑制剂的筛选。提出了新的空白概念和最佳的ｐＨ范围，建立了四种溶剂体系，可溶解各类送检样本，检测了各类化合物及其衍生物，发现了开发高效除草剂的先导化合物，给出了ＡＬＳ酶抑制中浓度ＩＣ50值。

主权项

1.乙酰乳酸合成酶抑制剂筛选方法，其特征在于：选用乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂，酶促反应的反应物由缓冲液、底物和辅酶配制而成，反应过程表达为：测定反应体系中不含被筛选物的酶促反应速率V0和反应体系中加入被筛选物后的酶促反应速率V1，根据二者比值，确定抑制活性百分数i％，其公式为：i%=(1-V1V0)×100%---(1)]]>反应速率V可用测定酶活即随时间而变化的产物的增加量代表，用E表示，则公式(1)成为：i%=(1-E1E0)×100%---(2)]]>根据测定的E值，计算出被筛选物的抑制活性i％，根据抑制活性i％判断是否为抑制剂及抑制剂的优劣，就可筛选出抑制剂，其筛选过程包括以下步骤：(1).首先选用比活值5-12μm/mg·hr，体积为0.2-0.5ml的乙酰乳酸合成酶做酶促反应的催化剂；(2).确定能完全溶解被筛选物的一种溶剂，并配制成浓度为2mg/ml的溶液；(3).确定进行酶促反应的反应物所含缓冲液、底物和辅酶的组成及在反应体系中的浓度如下：缓冲液：磷酸氢二钾K2HPO4?20mM底??物：丙酮酸钠CH3·CO·COOH?15.5mM辅??酶：氯化镁MgCl2?0.4mM????????硫胺素焦磷酸TPP?0.4mM????????黄素腺嘌呤双核苷酸FAD?8μM(4).在四个试管中，分别先加入0.5ml的酶和0.6ml?20mM的K2HPO4，再按以下四种情况(I，II，III，IV)加入或不加入溶剂，被筛选物溶液，反应物及适量的H2O，配制成2.6ml的反应溶液体系，该体系的PH值为6.9-7.5，在常压，39-40℃，进行1小时酶促反应，生成产物乙酰乳酸，表达式如下：按以下四种情况分别测出产物量E值：在反应体系中加入溶解被筛选物的溶剂0.1ml而不加被筛选物时：I.测定反应体系中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA；II.测定反应体系中加入1ml反应物后的酶促反应产物量EB；在反应体系中加入0.1ml被筛选物溶液时：III.测定反应体系中不含反应物时的酶促反应空白产物量EA1；IV.测定反应体系中加入1ml反应物后的酶促反应产物量EB1；(5).确定乙酰乳酸合成酶的活性E0，该活性等于加入反应物后的酶促反应产物量EB与没有反应物量EA之差，该值表达式：???????????????????E0＝EB-EA(6).确定乙酰乳酸合成酶在有被筛选物存在时的活性E1，该活性等于加入反应物后的酶促反应产物量EB1与没有反应物时的酶促反应产物量EA1之差，该值表达式：???????????????????E1＝EB1-EA1(7)根据权利要求1中的公式(2)，计算被筛选物的抑制活性，酶活性测定选用分光光度法，系测定产物乙酰乳酸在硫酸作用下转化为3-羟基丁酮的含量，反应过程表达为：分光光度法测E值依次包括如下步骤：①.向2.6ml的酶促反应溶液体系中加入0.05-0.25ml，6N的H2SO4；②.将上述溶液在59-60℃下恒温15分钟；③.加入0.5-1.5ml，0.5％的肌酸；④.再加入1-2ml，5％的1-碱萘酚，生成红色络合物；⑤.测定溶液体积为3-7ml；在59-60℃，常压下恒温20分钟；⑥.取出溶液，摇匀后室温放置30-40分钟；⑦.用分光光度仪测定E值，波长为520nm，1cm比色皿。